一种无两性电解质自由流等电聚焦电泳分离方法与流程

本发明涉及自由流电泳分离技术领域，具体的说，是一种无两性电解质自由流等电聚焦电泳分离方法。

背景技术：

蛋白质是生命活动的物质基础，种类繁多，功能多样。其是由氨基酸通过酰胺键连接成的、具有特定结构和功能的生物大分子。它能够执行各种各样的生物学功能，使dna中蕴藏的信息得以显现。蛋白质是生命活动最直接的体现者，只有蛋白质组的研究才能从根本上阐释生命过程。而蛋白质的分离技术是蛋白质组研究的基础。但由于蛋白质自身所具有的特殊性质，很难使用常规的分离技术进行有效的分离。

自由流电泳是一种连续的全液相分离技术，其装置由两块距离很近的平行板组成一个薄的分离腔。运行流动相从分离腔中流过，形成稳定的层流。样品通过进样口进入分离腔后，被液流驱动流向出口端。同时通过对装置中纵向流动的液体层流加载一个正交的横向电场，使层流中的带电荷样品在电场力的作用下按照不同的电泳淌度发生不同程度的横向偏移，从而达到分离的效果。自由流电泳分离过程中样品连续进入，无固体支持介质，且分离环境温和，特别适用于蛋白质等生物样品的分离制备。曹成喜课题组在2013年研制了一种带有冷却系统的易操作的稳定自由流电泳装置，大大的提升了自由流电泳装置的可操作性。自由流电泳能够与其他电泳技术相结合，充分利用其他电泳技术的优点，使得自由流电泳能够在更多的领域发挥作用。最常见的几种分离模式分别是自由流区带电泳、自由流等电聚焦、自由流等速电泳、自由流电场梯度电泳等。曹成喜课题组在2017年开发了一种移动反应界面自由流电泳方法，用于蛋白质的连续浓缩。自由流等电聚焦电泳在常见的自由流电泳分离模式中具有最高的分辨率，所以常常被用于较难分离样品的分离。曹成喜课题组在2017年使用循环自由流等电聚焦装置成功的制备了内源性线粒体。该方法使用一系列具有ph梯度的高浓度两性电解质作为运行流动相，在循环自由流等电聚焦装置中建立了ph梯度来对样品进行分离。等电聚焦是20世纪60年代出现的一种主要用于蛋白质分离的手段。由于其具有较高的分辨率，所以得到快速的发展。它的基本原理是利用各种蛋白质样品的等电点不同，在一个连续的线性ph梯度中进行蛋白质的分离分析。等电聚焦的过程是一个样品聚焦的过程，因此其条带扩散问题较小，可同时达到分离和浓缩的目的。在传统的自由流等电聚焦电泳过程中，需要特定的两性电解质缓冲溶液来建立ph梯度。但两性电解质溶液不但昂贵，且可能会与部分样品产生相互作用，影响紫外检测的灵敏度。当分离后的组分需要接质谱检测时，必须通过复杂的手段将这些两性电解质去除。因此不使用两性电解质缓冲溶液进行自由流等电聚焦电泳将会是一种理想的操作方法。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术的不足，本申请提供了一种无两性电解质自由流等电聚焦电泳分离方法。

本申请采用的技术方案是：

一种无两性电解质自由流等电聚焦电泳分离方法，其具体步骤为：

第一步：使用驱动泵将运行流动相泵入自由流电泳装置的分离腔内,并保持流动相稳定运行；

第二步：使用电极液循环泵将电极液储罐中的正极电极液泵入自由流电泳装置的正极室中并保持电极液循环，将电极液储罐中的负极电极液泵入自由流电泳装置的负极室中并保持电极液循环；

第三步：在两个电极施加电压，调节电压至适当值，并保持装置稳定运行，使其在分离腔的后部，电极间自动形成稳定的ph梯度。

上述自由流等电聚焦电泳方法使用一种自由流电泳装置，所述自由流电泳装置其包含运行流动相储液瓶,运行流动相驱动泵,气液缓冲装置，自由流电泳腔，正极电极室，负极电极室，正极电极液循环泵，负极电极液循环泵，正极电极液储液瓶，负极电极液储液瓶，高压电源，组分收集装置；运行流动相储液瓶通过软管与运行流动相驱动泵进行连接，运行流动相驱动泵通过软管与气液缓冲装置进行连接，气液缓冲装置通过软管与自由流电泳腔进行连接,自由流电泳腔通过软管与组分收集装置进行连接，自由流电泳腔通过阳离子交换膜与正极室进行连接,正极室通过电极棒与高压电源正极进行连接,正极室通过软管与正极电极液循环泵进行连接，正极电极液循环泵通过软管与正极电极液储液瓶进行连接，自由流电泳腔通过阴离子交换膜与负极室进行连接,负极室通过电极棒与高压电源负极进行连接，负极室通过软管与负极电极液循环泵进行连接，负极电极液循环泵通过软管与负极电极液储液瓶进行连接。

自由流电泳装置中阳极使用酸性电极液，所述酸性电极液的浓度为0.01mol/l-1mol/l。

自由流电泳装置中阴极使用碱性电极液，所述碱性电极液的浓度为0.01mol/l-1mol/l。

自由流电泳装置在运行过程中使用缓冲溶液作为运行流动相，所述缓冲溶液浓度为0.001mol/l-0.1mol/l。

自由流电泳装置运行流动相流速为1ml/min-100ml/min。

自由流等电聚焦电泳方法可以在电场力作用下形成ph2-10，优选3-8的ph梯度。

本申请提供了无两性电解质自由流等电聚焦电泳在蛋白质分离中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

无需使用昂贵的特殊两性电解质作为运行流动相来形成ph梯度。电极室内电极液中的氢离子和氢氧根离子在电场力的作用下在自由流电泳腔内能够自动形成ph梯度。

正极电极室内的正极电极液通过正极电极液循环泵与正极电极液储液瓶中的正极电极液循环使用，使正极电极室内的正极电极液保持浓度的稳定。负极电极室内的负极电极液通过负极电极液循环泵与负极电极液储液瓶中的负极电极液循环使用，使负极电极室内的负极电极液保持浓度的稳定。从而保障自由流电泳腔内的ph梯度稳定。

所使用的缓冲溶液不会与样品相互作用，相对于两性电解质作为运行流动相提高了uv检测时的灵敏度。

当自由流电泳分离后的组分需要连接质谱检测时，由于使用的缓冲溶液浓度很低，不会增加离子电流并且无需脱盐处理。

附图说明

图1为自由流电泳装置示意图。

图2为自由流电泳分离腔示意图。

图3为ph梯度曲线；

图4为鸡蛋清蛋白分离组分通过基质辅助激光解析电离源飞行时间质谱仪检测后的质谱图；图4a为第一孔的示意图，图4b为第四孔的示意图，图4c为第九孔的示意图。

附图中的标记为：1—运行流动相驱动泵，2—负极液循环泵，3—正极电极液循环泵，4—进样泵，5—负极电极液储液瓶，6—运行流动相储液瓶，7—样品溶液储液瓶，8—正极电极液储液瓶，9—高压电源，10—气筒，11—气液缓冲装置，12—自由流电泳腔，13—组分收集装置；121—正极电极室，122—负极电极室，123—自由流电泳分离腔，124-运行流动相输入管道。

具体实施方式

有关本发明的详细技术内容及其较佳实施如下，但并不能限制本发明内容，配合附图内容说明如下。

实施例1

请参阅图1所示，本申请所使用的自由流电泳装置示意图。此装置包括：一运行流动相驱动泵(1)用于驱动运行流动相储液瓶(6)中的运行流动相进入气液缓冲装置(11)中。使用气液缓冲装置(11)中的气筒(10)将运行流动相中的气泡去除，使运行流动相充满自由流电泳腔体(12)；负极电极液循环泵(2)用于驱动负极电极液储液罐(5)中的负极电极液循环，正极电极液循环泵(3)用于驱动正极电极液储液罐(8)中的正极电极液循环；一进样泵(4)用于将样品溶液储液瓶(7)中的样品泵入自由流电泳腔体(12)；一高压电源(9)用于提供装置电压；一组分收集装置(13)。

参阅图2所示，本发明所使用的自由流电泳装置中自由流电泳腔示意图。此装置包括：一运行流动相输入管道(124)；一正极电极室(121)由阳离子交换膜与自由流电泳分离腔(123)相隔；一负极电极室(122)由阴离子交换膜与自由流电泳分离腔(123)相隔。

自由流等电聚焦电泳的过程中，在运行流动相运行的方向上，主要是由运行流动相驱动泵(1)提供推动力，使运行流动相和样品溶液一同由自由流电泳腔(12)的入口流向出口。与运行流动相垂直的方向上可以看成一个等电聚焦的过程。在这个过程中高压电源(9)提供电压，使正极电极室(121)内的氢离子在电场作用下通过正极电极室(121)的阳离子交换膜向负极移动，负极电极室(122)内的氢氧根离子在电场作用下通过负极电极室(122)的阴离子交换膜向正极移动。正极附近的运行流动相由于氢离子浓度的增大使其呈酸性，而负极附近的运行流动相由于氢氧根离子浓度增大呈碱性。在自由流电泳腔(12)的中间部分，因氢离子和氢氧根离子在电场作用下的迁移，形成接近线性的ph值梯度，ph梯度曲线如图3所示。

实施例2

第一步打开运行流动相驱动泵(1)将运行流动相储液瓶(6)中的运行流动相泵入气液缓冲装置(11)中。使用气液缓冲装置(11)中的气筒(10)将运行流动相中的气泡去除，使运行流动相充满自由流电泳腔体(12)并将流速控制在1ml/min。打开负极电极液循环泵(2)和正极电极液循环泵(3)使负极电极液储罐(5)和正极电极液储液罐(8)中的正负极电极液泵入自由流电泳腔的正负极电极室中，并保持电极液循环。打开高压电源(9)，调节至400v电压。保持装置运行稳定30min时间，使其稳定。打开进样泵(4)将样品溶液储液瓶(7)中的鸡蛋清样品溶液以1ml/min的速度泵入自由流电泳腔体(12)中。在电场力的作用下运行1h后，样品得到分离浓缩，然后由组分收集装置(13)收集。收集后的鸡蛋清蛋白分离组分通过基质辅助激光解析电离源飞行时间质谱仪检测，得到的结果如图4所示：通过使用这种自由流等电聚焦电泳方法，将鸡蛋清溶液中的三种蛋白组分完全按照其等电点分离。且在质谱检测前无需脱盐处理。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。