基于N-烷基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法与流程

本发明属于人体氨基代谢物测量
技术领域：
，具体涉及基于n-烷基化衍生方法的多种氨基代谢物同步定量分析方法。
背景技术：
：含有氨基的代谢物(氨基代谢物)是一类重要的生物代谢物，涵盖数十个重要的代谢通路。它们在维持氧化还原平衡、蛋白质与核酸及神经递质的合成、能量代谢等多个方面具有重要功能。因此其含量变化与糖尿病、肝病等多种疾病的发生发展机制密切相关。譬如，支链氨基酸在糖尿病及患有严重肝脏疾病的病人与正常人体液中含量具有明显差异；多巴胺含量下降与帕金森病直接相关；5-羟色胺对记忆、抑郁和焦虑型障碍有关键作用等。因而，氨基代谢物的高通量同步定量分析对疾病的精准诊疗具有重要意义。由于生物基质的复杂性以及氨基代谢物较多的种类和较大的浓度动态范围，目前基于uhplc-ms的氨基代谢物定量分析存在以下难点：第一，这类代谢物大多极性强，不适用于反相柱分离，而亲水色谱的重现性较差并需要较长的柱平衡时间；第二，部分代谢物的离子化效率低，灵敏度不高；第三，由于生物基质的复杂，通过外标法很难实现准确定量，而同位素内标价格昂贵且不易获得。为了解决以上问题，需通过衍生化增加氨基代谢物的疏水性，且衍生化试剂需反应条件温和，特异性强，效率高，易淬灭，后处理简单，可引入稳定同位素，从而通过色谱质谱技术实现准确内标定量。技术实现要素：本发明的目的是提供一种反应条件温和，特异性强，效率高，易淬灭，后处理简单的多种氨基代谢物同步定量分析方法。本发明提供的多种氨基代谢物同步定量分析方法，是基于氨基代谢物的一类n-烷基化柱前衍生化方法(简称“n-烷基化法”)，然后通过uhplc-ms/ms方法同时对多种人体氨基代谢物进行高灵敏的内标定量分析。本发明方法易操作且检测灵敏度高。本发明提供的基于n-烷基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法，具体步骤如下：(1)氨基代谢物标准溶液的配制：取氨基代谢物标品，用体积比50-70％的甲醇水溶液配制成浓度为10-600μm的标准溶液；(2)氨基代谢物的衍生化反应：在含n-乙基马来酰亚胺(nem，其浓度为2-5倍氨基代谢物浓度)的磷酸缓冲液中(缓冲液浓度为0.1-0.3m，ph为7-8)，加入氨基代谢物标准溶液，20-30℃反应1-20min，然后加入4-叔丁基苯硫酚(tbbt，其浓度为5-10倍nem浓度)，20-30℃反应2-10min，再加入含三(2-羧乙基)膦(tcep，其浓度为5-20倍氨基代谢物浓度)和抗坏血酸(vc，其浓度为5-20倍氨基代谢物浓度)的醋酸缓冲液(保证反应液中浓度为0.1-0.5m，ph为5-7)，涡旋混匀10-20min，再加入nabh3cn或者nabd3cn(其浓度为100-200倍氨基代谢物浓度)，涡旋混匀，再加入醛溶液(这里醛为乙醛、丙醛、丁醛、戊醛或者己醛，其浓度为250-500倍氨基代谢物浓度)，25-37℃反应12-24h；然后用盐酸调节反应液ph至2-3，淬灭反应，稀释后加入内标(图1为衍生化反应流程)；(3)烷基化氨基代谢物的检测：采用uhplc-ms/ms(超高效液相色谱-串联质谱)进行测定。本发明步骤(1)中，所述氨基代谢物包括亮氨酸，甘氨酸，半胱氨酸等必需氨基酸，s-腺苷甲硫氨酸，s-腺苷高半胱氨酸等含腺苷类氨基代谢物，组氨酸，多巴胺等神经递质，以及其他类别的氨基代谢物。本发明步骤(2)中，衍生化反应采用不含稳定同位素标记的nabh3cn对代谢物进行衍生化处理，可得到不带标记的衍生物(轻标)，而采用稳定同位素标记试剂nabd3cn对代谢物进行衍生化处理，可得到含氘标记的衍生物(重标)，重标可作为内标用于定量分析。本发明步骤(3)中，测定条件为：a、色谱条件：使用uhplc系统，采用c18反相色谱柱；流动相a配置为含有0.05-0.1％甲酸的双蒸水，流动相b为含有0.05-0.1％甲酸的乙腈；流速设为0.400-0.600ml/min，进样量设为0.2-5.0μl，柱温设为35-45℃；b、质谱条件：使用qqqms系统，采用esi离子源，干燥气温度：150-290℃，干燥气流量：10-20l/min，雾化器压力：40-60psi，鞘气温度：250-400℃，鞘气流量：5-12l/min，毛细管电压：3500-4000v，喷嘴电压：400-600v；数据采集使用正离子、dmrm模式，采样前0.5min进废液瓶。本发明方法中，还通过大量筛选实验，得到如下优选条件：步骤(2)中，考虑到含巯基氨基代谢物易氧化缩合生成二硫键从而影响代谢物的准确定量，本发明使用nem试剂与含巯基的氨基代谢物发生烷基化反应，并尝试了不同反应物比例，ph，温度，时间后，优选2倍过量nem，ph为7.4条件，25℃反应1min。过量的nem试剂通过加入tbbt淬灭，通过比较不同反应比例及时间后，优选5倍过量tbbt，反应2min。另外考虑到部分氨基代谢物易氧化的特性，本发明测试了不同抗氧化剂，优选加入10倍代谢物浓度的tcep和vc作为抗氧化剂。在n-烷基化反应过程中，本发明比较不同反应ph，缓冲液及浓度，反应比例，温度及时间，优先反应ph为5.2，浓度为0.2m的磷酸缓冲液，反应比例为100倍过量nabh3cn及250倍过量醛溶液，反应温度为37℃，反应时间为12h。步骤(3)中，通过分析烷基化产物在质谱中的碎片离子信息，分别优选了轻标及重标离子对及碰撞能用于准确的定性和定量分析，具体信息如表1—表5所示(分别是乙基化，丙基化，丁基化，戊基化及己基化优化结果)：表1乙基化代谢物的离子对，碰撞能及碎片形式*代表重标结果。表2丙基化代谢物的离子对，碰撞能及碎片形式*代表重标结果。表3丁基化代谢物的离子对，碰撞能及碎片形式*代表重标结果。表4戊基化代谢物的离子对，碰撞能及碎片形式*代表重标结果。表5己基化代谢物的离子对，碰撞能及碎片形式*代表重标结果。与现有技术相比，本发明的有益效果是：1、采用烷基化的方法有效改善了氨基代谢物在反相色谱柱上的保留；2、n-烷基化结构提供了电离基团从而提升质谱响应；3、采用nabh3cn/nabd3cn作为稳定同位素标记试剂，可实现更为精确的内标定量；4、衍生化过程温和、操作简便、反应效率高，适用于多种氨基代谢物的同步定量分析。附图说明图1为烷基化反应流程图。具体实施方式实施例：丁基化用于肝脏中半胱氨酸、s-腺苷甲硫氨酸和s-腺苷高半胱氨酸的定量分析一、实验材料与仪器实验材料：乙腈，甲醇，二甲基亚砜，n-乙基马来酰亚胺，抗坏血酸，半胱氨酸(cys)，s-腺苷甲硫氨酸(sam)和s-腺苷高半胱氨酸(sah)均来自于sigma；乙醛，丙醛，丁醛，戊醛，己醛，三(2-羧乙基)膦盐酸盐，4-叔丁基苯硫酚，氰基硼氢化钠均来自于阿拉丁；盐酸，磷酸二氢钠，磷酸氢二钾均来自于国药；肝脏样品来源于肺癌小鼠。实验仪器：agilent1290uhplc系统，包括dad检测器、自动进样器、二元梯度泵、温控单元等模块。配备的色谱柱为acquityuplchsst3c18(1.8μm，2.1mm×100mm)反相色谱柱。质谱为agilent6459qqqms。二、色谱质谱条件色谱条件：对于uhplc系统，采用acquityuplchsst3c18(1.8μm，2.1mm×100mm)反相色谱柱。流动相a配置为含有0.1％甲酸的双蒸水，流动相b为含有0.1％甲酸的乙腈溶液，其中洗脱梯度以流动相b百分比表示为：0.00-2.00min，1.00％；2.00-4.00min，1.00-3.80％；4.00-8.00min，3.80-22.00％；8.00-12.00min，22.00-25.00％；12.00-13.00min，25.00-60.00％；13.00-13.50min，60.00％；13.50-13.51min，60.00-80.00％；13.51-16.00min，80.00-95.00％。流速设为0.500ml/min，进样量设为1.00μl，柱温设为40℃；质谱条件：采用esi离子源，干燥气温度：250℃，干燥气流量：12l/min，雾化气压力：50psi，鞘气温度：350℃，鞘气流量：12l/min，毛细管电压：4000v，喷嘴电压：500v。数据采集采用正离子、dmrm模式，采样前0.5min进废液瓶。三、实验过程(1)氨基代谢物溶液的配制：取适量半胱氨酸，s-腺苷甲硫氨酸和s-腺苷高半胱氨酸，用体积比50％的甲醇水溶液配制成浓度分别为53.3μm，73.4μm，100μm的标准混合溶液。(2)氨基代谢物的衍生化反应及线性曲线建立：取80μl含n-乙基马来酰亚胺(nem，浓度为2.5mm)的磷酸缓冲液(缓冲液浓度为0.2m，ph为7.4)于0.5ml棕色ep管中，加入10μl氨基代谢物标准溶液，25℃涡旋反应1min后加入10μl4-叔丁基苯硫酚(tbbt，浓度为100mm)，25℃涡旋反应2min后离心取上清液50μl加入37μl含三(2-羧乙基)膦(tcep，浓度为20mm)和抗坏血酸(vc，浓度为10mm)的醋酸缓冲液(ph为5.2，浓度0.54m，含50％甲醇水)，37℃涡旋混匀10min后加入5μlnabh3cn或者nabd3cn(浓度为1.5m，甲醇为溶剂)，涡旋混匀后加入5μl醛溶液(浓度为5m，甲醇稀释)，37℃反应12h，然后加入3μl6m盐酸淬灭反应。含轻标衍生化标品按1:2:2.5:2:2.5:2:2.5:2:2.5:2:2.5:2稀释为12个梯度，每个梯度取39μl稀释液加入1μl含重标衍生化标品，经0.22μm滤膜过滤进入uhplc-ms/ms检测。(3)肝脏样品的前处理及衍生化：于样品30mg左右加入400μl80％冷甲醇/水涡旋混匀，组织破碎三次，超声10次(超停1min)，离心取上清液，重复以上操作两次，上清混合挥干溶剂后，加入90μl含n-乙基马来酰亚胺(nem，浓度为2.5mm)的磷酸缓冲液(缓冲液浓度为0.2m，ph为7.4)于0.5ml棕色ep管中，25℃涡旋反应1min后加入10μl4-叔丁基苯硫酚(tbbt，浓度为100mm)，25℃涡旋反应2min后离心取上清液50μl加入37μl含三(2-羧乙基)膦(tcep，浓度为20mm)和抗坏血酸(vc，浓度为10mm)的醋酸缓冲液(ph为5.2，浓度0.54m，含50％甲醇水)，37℃涡旋混匀10min后加入5μlnabh3cn或者nabd3cn(浓度为1.5m，甲醇为溶剂)，涡旋混匀后加入5μl醛溶液(浓度为5m，甲醇稀释)，37℃反应12h，然后加入3μl6m盐酸淬灭反应。每个样品稀释十倍后取39μl稀释液加入1μl含重标衍生化标品，经0.22μm滤膜过滤进入uhplc-ms/ms检测。(4)检测结果：检测靶标线性及结果如表6、表7所示：表6检测靶标及线性表7检测结果样品编号cys(pmol/mg)sah(pmol/mg)sam(pmol/mg)1--1219.18119.9644.411--2216.82119.496.631--3190.0092.8612.951--4334.58143.9425.591--5308.84122.9642.641--6243.20109.0637.822--1631.8976.6038.902--2395.8781.6619.352--3445.5392.534.952--4503.6685.812.762--5669.50180.5339.752--6575.5780.21150.862--7428.7373.3214.433--1419.2543.49240.233--2579.4269.05383.593--3612.7247.7269.823--4553.6152.49440.083--5599.7779.48319.443--6607.4580.86287.95。(5)结果分析：半胱氨酸，s-腺苷甲硫氨酸和s-腺苷高半胱氨酸r2均大于0.99，说明线性关系良好，lod均低于2fmol，说明该方法具有较高灵敏度。检测结果显示，在小鼠肝脏中均能检测较高含量的半胱氨酸，s-腺苷甲硫氨酸和s-腺苷高半胱氨酸，说明该方法适用于肝脏等组织样品的检测。当前第1页12