一种QuEChERS-LC-MS/MS同时测定卷烟烟气中10种芳香胺的方法与流程

本发明属于烟气有害化学成分分析测定技术领域，具体涉及一种quechers-lc-ms/ms同时测定卷烟烟气中10种芳香胺的方法。

背景技术：

芳香胺是卷烟烟气中存在的一类重要的有害物质，其中邻甲苯胺(o-tol)、1-氨基萘(1-na)、2-氨基萘(2-na)、3-氨基联苯(3-abp)和4-氨基联苯(4-abp)，2,6-二甲基苯胺(2,6-dma)，邻甲氧基苯胺(o-asd)等芳香胺已被国际癌症研究机构(iarc)列为致癌物或可能的致癌物。深入研究主流烟气中芳香胺的分析方法，对正确评价吸烟对健康的危害具有重要意义。

由于芳香胺类化合物中部分高毒性芳香胺，如1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯、4-氨基联苯、2,6-二甲基苯胺和邻甲氧基苯胺等含量极低，且邻甲苯胺、间甲苯胺与对甲苯胺，1-氨基萘与2-氨基萘,3-氨基联苯与4-氨基联苯等芳香胺互为同分异构体，且均存在于主流烟气中，因此，要实现这几对芳香胺的准确测定，需将其基线分离，加之卷烟烟气非常复杂，干扰较多，因此芳香胺的准确测定仍是一项极有挑战性的工作。

芳香胺化合物的检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-串联质谱法等。目前常用的方法是国家标准gb/t23358-2009“卷烟主流烟气总粒相物中主要芳香胺的测定气相色谱-质谱联用法”。此方法的研究对象仅为四种芳香胺类化合物，即1-氨基萘、2-氨基萘、3-氨基联苯和4-氨基联苯，且采用该方法测定时，样品前处理需要多步液液萃取、浓缩、衍生化反应等步骤，费时费力，不适用于大量样品的检测。近年来公布的芳香胺液相色谱-串联质谱测定方法中，中国专利cn102608232b公开了一种液相色谱-串联质谱法检测卷烟主流烟气中10种芳香胺类化合物的方法，该方法邻甲苯胺、间甲苯胺与对甲苯胺的分离度不够，同分异构体之间相互干扰，难以实现此种芳香胺的准确测定。中国专利cn106290687b公开了一种应用在线spe/lc-ms/ms测定卷烟主流烟气中6种芳香胺类化合物的方法，该方法分析对象未涉及间甲苯胺、对甲苯胺和3-氨基联苯，但邻甲苯胺、间甲苯胺与对甲苯胺，3-氨基联苯和4-氨基联苯这两对同分异构体均同时存在于主流烟气中，且不易分离，方法易存在同分异构体干扰的问题。此外，两方法均采用剑桥滤片来捕集粒相物中的芳香胺，采用加入捕集液的吸收阱来捕集气相物中的芳香胺，合并后测定总的芳香胺含量。然而，接装吸收阱过程，步骤较为繁琐，费时费力，给检测工作带来了不便。因此，要实现此芳香胺类化合物的准确、高效测定，有必要采用更有效的方法使所测芳香胺实现基线分离，同时采用更有效的样品前处理方法，提高检测效率。

技术实现要素：

本发明的目的正是基于上述研究现状而提供的一种基于quechers结合液相色谱-串联质谱同时测定卷烟主流烟气中10种芳香胺类化合物的方法，该方法灵敏度高、准确性好，显著提高了检测效率。

本发明所述的基于一种quechers结合液相色谱-串联质谱同时测定卷烟主流烟气中10种芳香胺类化合物的方法，包括以下步骤：

(1)将10种芳香胺标准品及内标物配置成不同浓度的混合标准工作液；所述的10种芳香胺为苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、1-氨基萘、2-氨基萘，3-氨基联苯、4-氨基联苯、2,6-二甲基苯胺和邻甲氧基苯胺；

(2)分别对所述不同浓度的混合标准工作液进行液相色谱-串联质谱分析测定，形成所述10种芳香胺的标准工作曲线；

(3)以剑桥滤片对待测样品的主流烟气气相物和粒相物进行捕集；

(4)对完成捕集的剑桥滤片进行萃取，将萃取液进行quechers样品前处理；

(5)对经quechers样品前处理的萃取液进行与步骤(2)相同条件的液相色谱-串联质谱分析测定，结合测定结果与所述标准工作曲线计算待测样品主流烟气中10种芳香胺的含量。

优选地，所述内标物为邻甲苯胺-d7(o-tol-d7)、1-氨基萘-d7(1-na-d7)、2-氨基萘-d7(2-na-d7)、3-氨基联苯-d9(3abp-d9)、4-氨基联苯-d9(4abp-d9)和邻甲氧基苯胺-d3(o-asd-d3)。

更具体而言，邻甲苯胺-d7为邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、苯胺和2,6-二甲基苯胺的内标，1-氨基萘-d7为1-氨基萘的内标，2-氨基萘-d7为2-氨基萘的内标，3-氨基联苯-d9为3-氨基联苯的内标，4-氨基联苯-d9为4-氨基联苯的内标，邻甲氧基苯胺-d3为邻甲氧基苯胺的内标。

本发明所述方法，对不同浓度的混合标准工作液(也可成为系统标准溶液)进行液相色谱-串联质谱分析测定，以tsnas峰面积与内标峰面积之比(y)对其质量浓度(x，pg/ml)建立线性回归方程。

此处的“不同浓度的混合标准工作液”的具体指代为本领域技术人员所掌握，本发明对此不作特别限定，可设置尽可能多的浓度梯度以提高精度，浓度梯度的设计应依据各种芳香胺在主流烟气中的常见含量范围针对性拟定，具体的梯度不低于3级，优选在3-10级，更优选3-6级。

作为理想的选择之一：如各种芳香胺标准品各设置至少高、中、低三个浓度，合适的浓度如4-abp：0.1、0.2、0.3ng/ml；3-abp及o-asd：0.2、0.4、0.6ng/ml；2-na：0.5、1、1.5ng/ml；1-na及2,6-dma：1、2、3ng/ml；o-tol、m-tol及p-tol：5、10、15ng/ml；anl：25、50、70ng/ml。

优选地，所述剑桥滤片在捕集前经过如下处理：将2.0ml0.6mol/l盐酸-乙醇水溶液，均匀施加于所述剑桥滤片，置于恒温恒湿环境中平衡1～4h，优选2h。

采用上述处理条件，有利于减少滤片载水量，保证滤片的气体透过性，2.0ml捕集液可确保滤片施加均匀，湿度适宜。

上述操作优选以移液枪操作完成。

上述剑桥滤片优选为44mm剑桥滤片；进一步优选地，所述盐酸-乙醇水溶液，盐酸和乙醇的体积比为1:1。

本发明所述的方法，步骤(3)所述捕集采用湿膜片法，包括：

取未经处理及处理过的剑桥滤片各一张，分别置于夹烟器中(预处理滤片置于夹烟器的前端，且糙面均朝向烟气端)，同时捕集卷烟主流烟粒相物和气相物，以实现更充分的目标物捕集。

本发明所述的方法，以剑桥滤片捕集卷烟主流烟粒相物和气相物时，先根据iso8243:2006选取样品烟支，将样品参照iso3402:1999，在平衡箱中保持温度22℃±1℃，相对湿度60％±2％的条件下平衡48小时；调整吸烟机抽吸容量为35.0ml±0.3ml，按iso4387：2000抽吸方案抽吸5支卷烟。

优选地，步骤(4)所述萃取具体为：取出结束捕集的剑桥滤片，将其放入25-50ml0.6mol/l盐酸和50μl内标溶液，超声萃取30-60min，优选放入25ml0.6mol/l盐酸和50μl内标溶液，超声萃取30min。

上述内标溶液中的内标物为邻甲苯胺-d7(o-tol-d7)、1-氨基萘-d7(1-na-d7)、2-氨基萘-d7(2-na-d7)、3-氨基联苯-d9(3abp-d9)、4-氨基联苯-d9(4abp-d9)和邻甲氧基苯胺-d3(o-asd-d3)；优选所述内标溶液中，含o-tol-d7为5μg/ml,1-na-d7和2-na-d7为1μg/ml，3abp-d9,4abp-d9和o-asd-d3为0.5μg/ml。

优选地，所述quechers样品前处理具体为：将萃取液转移至50ml离心管中，用4.0mol/lnaoh溶液调节ph至12～13，加入10ml乙腈和10g无水硫酸镁，经剧烈振荡1min和涡旋萃取1min后，离心2min，取上层有机相至含有无水硫酸镁、psa和c18ec的分散固相萃取剂的试管中，涡旋振荡2min后，离心2min，取上清液氮吹至0.1ml，加入纯水定容至1ml，用0.22μm的针式滤器过滤。

采用上述处理条件，可最大程度上净化样品，降低基质效应，提高检测灵敏度，尤其是选择10ml的乙腈作为萃取剂，保障了萃取效率，一方面分析物可得到充分完全的萃取，另一方面避免了因体积过大带来的稀释效应影响浓缩效率。

进一步优选地，所述的分散固相萃取剂含有400mgpsa，400mgc18ec和1.2g无水硫酸镁(优选仅由上述组分组成)。

本发明选择使用含400mgpsa和400mgc18的净化剂对萃取样品进行净化，经实验证实，较其他方式/组合(如psa+gcb、plc+c18+gcb或单独的psa等)在相同用量的情况下净化效果有明显的优势，即能够很好地兼顾至少9中芳香胺的同步净化。

优选地，所述的液相色谱-串联质谱(下文简称为lc-ms/ms)分析测定采用的色谱条件为：色谱柱为agilentzorbaxeclipseplusphenyl-hexylcolumn(2.1mm×150mmi.d.,3.5μm)；流动相a为纯水，流动相b为加入0.25％甲酸的乙腈和甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇体积比为7：3；梯度洗脱条件：0～20.0min，95％～75％a；20.0～22.0min,75％a；22.0～24.0min,75％～60％a；24.1～26.0min，5％a,26.1～30.0min，95％a。

进一步优选地，所述色谱条件中，流速：0.3mlmin-1，柱温：30.0℃；进样量：10μl。

本发明所测定的芳香胺中，邻甲苯胺、间甲苯胺与对甲苯胺，1-氨基萘与2-氨基萘,3-氨基联苯与4-氨基联苯等芳香胺，邻甲氧基苯胺与间甲氧基苯胺互为同分异构体，性质极为相似，因此液相色谱分离十分困难。为实现所测芳香胺的液相色谱分离，本发明分别考察了多种色谱柱，包括但不局限于agilentporoshell120ec-c18(150mm×3.0mm，2.7μm)、waterssymmetryshieldtmrp18(150mm×2.1mm，3.5μm)、watersuplccshc18(100mm×3.0mm，1.7μm)、watersuplcbehc18(100mm×3.0mm，1.7μm)、agilentzorbaxeclipseplusphenyl-hexyl(2.1mm×150mm,3.5μm)等对10种芳香胺的分离效果，结果发现，前3种色谱柱对邻、间、对甲苯胺异构体的分离度较差，色谱柱watersuplcbehc18对邻、间、对甲苯胺异构体的分离较好，但对3-氨基联苯与4-氨基联苯的分离度较差，zorbaxeclipseplusphenyl-hexyl柱对所测芳香胺的分离效果最好，所测3对同分异构体均能够实现基线分离。

进一步地，本发明对流动相组成及梯度条件进行了优化。研究表明，流动相中加入一定比例的甲酸有助于芳香胺的离子化，提高质谱响应，且流动相的酸度对所测芳香胺的分离有较大影响，流动性酸性增强有利于3-氨基联苯与4-氨基联苯的分离，但不利于邻甲苯胺、间甲苯胺与对甲苯胺的分离，且有机相采用乙腈和甲醇的混合溶液有利于3-氨基联苯与4-氨基联苯的分离。通过系统优化，实验发现流动相组成为纯水a与含有0.25％甲酸的乙腈和甲醇的混合溶液(v:v,7:3)b以本发明中的梯度条件，3组芳香胺同分异构体可实现基线分离，且所测芳香胺峰型均较好，与干扰物能较好分离，可以满足定性、定量分析要求。

优选地，所述的lc-ms/ms分析采用电喷雾离子源(esi)正离子扫描模式：检测方式：多反应监测(mrm)；电喷雾电压(is)：5500v；雾化气(gas1)、辅助加热气(gas2)、气帘气、碰撞气为氮气，气体流量分别为65psi、65psi、30psi、7psi；离子源温度(tem)：500℃；驻留时间：50ms。

通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明所建立的quechers法处理主流烟气样品，有效净化了样品中的杂质，降低了基质效应，提高了方法准确性和灵敏度。

(2)本发明建立的卷烟主流烟气中10种芳香胺同时测定的方法，采用一种苯基-己基色谱柱实现了邻甲苯胺、间甲苯胺与对甲苯胺，1-氨基萘与2-氨基萘,3-氨基联苯与4-氨基联苯等芳香胺等同分异构体的基线分离，显著提高了测定方法的准确性。

(3)本发明采用浸润了捕集液的剑桥滤片直接捕集卷烟主流烟气中气、粒两相中的芳香胺，省去了接装吸收阱的过程，有效提高了检测效率。

附图说明

图1主流烟气样品中10种芳香胺的多反应监测色谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1.材料、试剂和仪器

样品：1r5f和3r4f参比卷烟(美国肯塔基大学)

苯胺(anl)、邻甲苯胺(o-tol)、间甲苯胺(m-tol)、对甲苯胺(p-tol)、1-氨基萘(1-na)、2-氨基萘(2-na)(美国accustandard公司)，3-氨基联苯(3-abp)、4-氨基联苯(4-abp)、2,6-二甲基苯胺(2,6-dma)，邻甲氧基苯胺(o-asd)(德国dr.ehrenstorfer公司)；o-tol-d7、1-na-d7、2-na-d7、3abp-d9、4abp-d9和o-asd-d3(加拿大trc公司)，超纯水(电导率≥18.2mo.cm)；乙腈、甲醇、甲酸(lc-ms级，美国fisherscientific公司)；甲酸(98％)、氨水(28％)(美国sigma-aldrich公司)，盐酸(36-38％，分析级,北京化工厂)。

symbiosis高效液相色谱(荷兰sparkholland公司)，api5500质谱议(美国应用生物系统公司)；milli-q50超纯水议(美国millipore公司)；cp2245分析天平(感量0.0001g,德国sartorius公司)；13mm×0.22μm亲水ptfe针式滤器、2ml无针注射器(上海安谱科学仪器有限公司)；tz-2ag台式往复旋转振荡器(北京沃德仪器公司)；bondelut分散相固相萃取试剂盒，(美国agilent公司)。

2.样品捕集与提取

根据iso8243:2006选取样品烟支，将样品参照iso3402:1999，在平衡箱中保持温度22℃±1℃，相对湿度60％±2％的条件下平衡48小时。用移液枪取2.0ml0.6mol/l盐酸-乙醇水溶液(乙醇:水＝1:1)，均匀施加于44mm剑桥滤片，置于恒温恒湿环境中(温度22℃±1℃，相对湿度60％±2％)平衡2h。

取两张剑桥滤片(1张为盐酸-乙醇水溶液预处理，1张为未处理)置于夹烟器中(预处理滤片置于夹烟器的前端，且糙面均朝向烟气端)，同时捕集卷烟主流烟粒相物和气相物，调整吸烟机抽吸容量为35.0ml±0.3ml，按iso4387：2000抽吸方案抽吸5支卷烟，烟气捕集完成后，取出剑桥滤片加入25ml0.6mol/l盐酸和50μl内标溶液(含o-tol-d7为5μg/ml,1-na-d7和2-na-d7为1μg/ml，3abp-d9,4abp-d9和o-asd-d3为0.5μg/ml)，超声萃取30min。

3.样品净化与分析

全部萃取液转移至50ml离心管中，用4.0mol/lnaoh溶液调节ph至12～13，加入10ml乙腈和10g无水硫酸镁，经剧烈振荡1min和涡旋萃取1min后，离心2min，取上层有机相至含有无水硫酸镁、psa和c18ec的分散固相萃取剂的试管中，涡旋振荡2min后，离心2min，取上清液氮吹至0.1ml，加入纯水定容至1ml，用0.22μm的针式滤器过滤后，进行lc/ms/ms分析。

4.色谱条件

lc-ms/ms分析采用agilentzorbaxeclipseplusphenyl-hexylcolumn(2.1mm×150mmi.d.,3.5μm)色谱柱进行色谱分离。流动相a为纯水，b为加入0.25％甲酸的乙腈和甲醇的混合溶液，乙腈和甲醇体积比为7：3；梯度洗脱条件：0～20.0min，95％～75％a；20.0～22.0min,75％a；22.0～24.0min,75％～60％a；24.1～26.0min，5％a,26.1～30.0min，95％a。流速：0.3mlmin-1，柱温：30.0℃；进样量：10μl。

5.质谱条件

lc-ms/ms分析采用电喷雾离子源(esi)正离子扫描模式。检测方式：多反应监测(mrm)；电喷雾电压(is)：5500v；雾化气(gas1)、辅助加热气(gas2)、气帘气、碰撞气为氮气，气体流量分别为65psi、65psi、30psi、7psi；离子源温度(tem)：500℃；驻留时间：50ms；mrm参数见表1。

表110种芳香胺的mrm参数

注：①a:定量离子，b:定性离子；②o-tol-d7作为anl、o-tol、m-tol、p-tol、2,6-dma的内标，1-na-d7作为1-na的内标，2-na-d7作为2-na的内标，3-abp-d9作为3-abp的内标，4-abp-d9作为4-abp的内标，o-asd-d3作为o-asd的内标。

1.方法的线性范围和检出限：

在最优的实验条件下，对系列浓度标准溶液进行测定，以tsnas峰面积与内标峰面积之比(y)对其质量浓度(x，pg/ml)建立线性回归方程，以3倍信噪比作为检出限，10倍信噪比作为定量限，结果见表2。

表210种芳香胺的线性曲线、相关系数、检出限和定量限

2.方法加标回收率和重复性：

取同一批次3r4f参比卷烟样品3组，分别按照低中高3个添加水平加入标准品，每个添加水平重复6次，计算回收率，结果见表3。分别在样品处理当日不同时间点和不同处理天数进样分析(n＝5)，计算日内和日间精密度。日间精密度分析时，每次进样结束后，将样品溶液更换密封垫密封，并于-20℃储存，以减少挥发和便于下次进样检测，精密度结果见表3。

表310种芳香胺的加标回收率、日内及日间精密度

实施例2

按照实施例1中的方法对10种市售卷烟进行测定，1-5号为烤烟型卷烟，6-10号为混合型卷烟。10种市售卷烟主流烟气中10种芳香胺的测定结果见表4，主流烟气样品中10种芳香胺的多反应监测色谱图见图1。表4显示苯胺、邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺、1-氨基萘、2-氨基萘，3-氨基联苯、4-氨基联苯、2,6-二甲基苯胺和邻甲氧基苯胺等10种芳香胺主流烟气的释放量分别为106.53ng/支、253.73ng/支、15.33ng/支、15.54ng/支、5.06ng/支、15.63ng/支、1.26ng/支、0.65ng/支、1.01ng/支和0.85ng/支。

表410种卷烟主流烟气中10种芳香胺的释放量

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。