本发明涉及一种高稳定性甲鱼油的制备方法及检测方法，属于食品制造技术领域。
背景技术：
中华鳖，俗称甲鱼，是一种珍贵的水产经济动物。甲鱼富含蛋白质、维生素及人体所需的必要微量元素等，对心脑血管疾病有很好的防控作用。近年来，随着甲鱼的养殖规模及消费市场的日益壮大，如何合理地处理甲鱼宰杀过程中所产生的大量废弃物是一大难题。若处理不当，不仅会造成资源的浪费，且易污染环境。现今，甲鱼加工废弃物主要用于甲鱼油的提取。甲鱼油中含有铁、锌、硒、铜等微量元素和丰富的花生四烯酸、亚麻酸、油酸、epa、dha等n-3系多不饱和脂肪酸。研究表明，epa、dha等具有健脑明目、降血压、降血脂、增加血液循环及抗炎等生理功效，且在临床上已被用于治疗和预防动脉硬化等相关疾病。
目前，对水产品加工废弃物中油脂的提取方法有很多种，如蒸煮法、酶解法、稀碱水解法、溶剂法和超声辅助溶剂法等。但是目前的仍然缺少一种即可兼顾提取率，又可保持甲鱼油中不饱和脂肪酸不受破坏的提取方法。
另外，甲鱼油中含有铁、锌、硒、铜等微量元素和丰富的花生四烯酸、亚麻酸、油酸、epa、dha等n-3多不饱和脂肪酸(pufa)。研究表明，其中epa、dha具有健脑明目、降血压、降血脂、增加血液循环及抗炎等生理功效，且在临床上已被用于治疗和预防动脉硬化等相关疾病。然而，甲鱼油中的n-3pufa极易受到化学、物理及生物因素作用的影响而产生一些影响其感官和品质的次级氧化产物，如己醛、壬醛、庚醛等，最终导致产品产生酸败气味、营养价值与可接受性的降低及货架期的缩短等不良后果。
技术实现要素：
本发明的目的在于，提供一种高稳定性甲鱼油的制备方法及检测方法。一方面，本发明的制备方法不仅提取率高，而且制备的甲鱼油中不饱和脂肪酸成分的成分稳定、不易变质，而且还具有较长的保存期限。另一方面，本发明的检测方法，可以快速准确地检测甲鱼鱼油中的成分变化、风味口感变化，可以为甲鱼油产品的货架期的制定提供较为有意义的参考。
本发明的技术方案：一种高稳定性甲鱼油的制备方法，其特点是，包括以下步骤：
①粉碎：取甲鱼脂肪，充分粉粹，得a品；
②冻结：将a品置于模具盒中，在-20℃下冷冻10小时，冻结成多个小块，得b品；
③二次粉碎：将b品置于研磨机中充分粉碎，得c品；
④自然解冻：将c品自然解冻至室温，得d品；
⑤加酶：将d品混入中性蛋白酶水溶液中，搅拌均匀，得e品；
⑥氮气升温：将e品置入细口容器中，并向e品通入高温氮气，对e品进行升温，得f品；
⑦超声处理:对f品进行超声处理，得g品；
⑧离心：对g品进行超声处理，取离心的上层液，得h品；
⑨调制：在h品种加入脂溶性茶多酚、维生素e和脂溶性迷迭香提取物的混合物，搅拌均匀，即可。
上述的高稳定性甲鱼油的制备方法中，所述步骤②中，每个冻结的小块的体积在3375mm3～5832mm3
前述的高稳定性甲鱼油的制备方法中，所述步骤⑤中的中性蛋白酶水溶液的浓度为7～9g/ml，且每千克d品混入中性蛋白酶水溶液1.4～1.6l。
前述的高稳定性甲鱼油的制备方法中，所步骤⑥中，通入的高温氮气温度为65～70℃；高温氮气通入方式是，在细口容器底部设置散气石，高温氮气输入管道连通至散气石，高温氮气以气泡形式上浮，在与e品进行热交换的同时搅动e品，使e品升温至60℃，然后调低高温氮气通入速度，使e品维持在60±2℃下2.5小时。
前述的高稳定性甲鱼油的制备方法中，所步骤⑦中，超声处理的超声频率为53hz，超声功率为350w，超声处理时间为15min，超声处理时，f品温度控制在60±2℃。
前述的高稳定性甲鱼油的制备方法中，所步骤⑧中，离心转速为4500r/min，离心时间为15min。
前述的高稳定性甲鱼油的制备方法中，所步骤⑨中，脂溶性茶多酚、维生素e和脂溶性迷迭香提取物的混合物的质量比为1:1.5:8；脂溶性茶多酚、维生素e和脂溶性迷迭香提取物的混合物的添加量为，每千克h品添加4克。
根据前述方法制得的高稳定性甲鱼油的检测方法，其特点是：称取0.1g甲鱼油样品于具塞试管中，加入2ml0.5mol/l的naoh-ch3oh溶液，充分摇匀，65℃水浴加热30min，取出后自然冷却，再加入2ml15％bf3-ch3oh溶液，充分摇匀，65℃水浴加热3min，取出后自然冷却，加入2ml正己烷提取，同时加入2ml饱和nacl溶液水洗，静止分层，取上层清液并加入1/10体积的无水na2so4去除溶液中痕量的水，将处理好的上层清液过有机相滤膜后用气相色谱仪进行脂肪酸相对含量测定；其中气相色谱的检测条件为：hp-88氰丙基色谱柱(30m×0.25mm,0.20μm)；载气：h2；不分流进样；进样量1μl；检测温度220℃；程序升温：起始柱温设定为70℃，以15℃/min升至120℃，保持1min，再以5℃/min升至175℃，保持10min；最后以5℃/min升至220℃，保持5min。
前述的高稳定性甲鱼油的检测方法，还包括挥发性风味化合物测定，其具体方法是：称取3g甲鱼油样品置于15ml顶空进样瓶中，60℃下平衡10min，并将老化好的50/30μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(dvb/car/pdms)涂层萃取头插入进样瓶顶空部分，60℃下吸附30min，取出后插入gc-ms进样口，250℃解吸3min；
其中gc条件：色谱柱为tr-35ms(30m×0.25mm,0.25μm)；载气：高纯氦气；进样口温度250℃，不分流进样；升温程序：初始温度40℃，保持3min，以5℃/min升至90℃，再以10℃/min升至230℃，保持7min；
ms条件：离子源温度200℃；电子离子源；电子能量70ev；传输线温度250℃；检测器温度280℃；质量扫描范围m/z30-500；
通过nist2.0谱库做自动检索确认分析，且仅当正反匹配度(si/rsi)均大于800(最大值为1000)的鉴定结果才予以保留；再采用峰面积归一化法求得各挥发性成分在样品中的相对百分含量。
与现有技术相比，本发明将冷冻、酶解及超声波等方法进行了有机结合，并精简了烦冗步骤，形成了一高效、高提取率、对脂肪成分破坏度较低的一种提取方法。本发明的提取方法得到的甲鱼油中酸价(av)与过氧化值(pov)较低，即其油脂的氧化程度较低，甲鱼油的脂肪成分在提取过程中的变化较少。而且经过碘值检测，本发明方法提取的甲鱼油中不饱和脂肪酸的含量也更高，没有因为提取过程而过度分解。
本发明的方法提取率可达78.51％，提取的甲鱼油为黄色，较澄清透亮，略有光泽。其酸价、过氧化值、皂化值等理化指标均优于其它传统方法提取的甲鱼油，并含有丰富的epa和dha，具有较高的生理活性功效，挥发性成分中醛类化合物(主要体现为鱼腥味)较少，仅4.38％，且其脂肪成分较为稳定、不易氧化，即使长时间的储存也不容易变质产生挥发性的气味。
本申请还在甲鱼油的制备过程中添加了由多种脂溶性天然抗氧化剂的组合配方，该品配方是发明人从无数天然抗氧化剂中筛选了3种，并反复研究、实验和总结它们的性能特点，通过科学的配比，使得可以有效抑制甲鱼油中脂肪酸含量变化，且持续时间长，可以有效提高甲鱼油产品的贮藏稳定性及延长货架期。
此外，本发明的检测方法可以快速准确地检测甲鱼鱼油中的成分变化、风味口感变化，可以为甲鱼油产品的货架期的制定提供较为有意义的参考。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
实施例。高稳定性甲鱼油的制备，包括以下步骤：
①粉碎：取甲鱼脂肪，充分粉粹，得a品；
②冻结：将a品置于模具盒中，在-20℃下冷冻10小时，冻结成多个小块，得b品；每个冻结的小块的体积在3375mm3～5832mm3。
③二次粉碎：将b品置于研磨机中充分粉碎，得c品；
④自然解冻：将c品自然解冻至室温，得d品；
⑤加酶：将d品混入中性蛋白酶水溶液中，搅拌均匀，得e品；中性蛋白酶水溶液的浓度为7～9g/ml，且每千克d品混入中性蛋白酶水溶液1.4～1.6l。
⑥氮气升温：将e品置入细口容器中，并向e品通入高温氮气，对e品进行升温，得f品；通入的高温氮气温度为65～70℃；高温氮气通入方式是，在细口容器底部设置散气石，高温氮气输入管道连通至散气石，高温氮气以气泡形式上浮，在与e品进行热交换的同时搅动e品，使e品升温至60℃，然后调低高温氮气通入速度，使e品维持在60±2℃下2.5小时。
⑦超声处理:对f品进行超声处理，得g品；超声处理的超声频率为53hz，超声功率为350w，超声处理时间为15min，超声处理时，f品温度控制在60±2℃。
⑧离心：对g品进行超声处理，取离心的上层液，得h品；离心转速为4500r/min，离心时间为15min。
⑨调制：在h品种加入脂溶性茶多酚、维生素e和脂溶性迷迭香提取物的混合物，搅拌均匀，即可。脂溶性茶多酚、维生素e和脂溶性迷迭香提取物的混合物的质量比为1:1.5:8；脂溶性茶多酚(ltp)、维生素e(ve)和脂溶性迷迭香提取物(lro)的混合物的添加量为，每千克h品添加4克。其中，ltp，杭州普丽美地科技有限公司；ve，苏州佰耀生物科技有限公司；lro，河南森源本草天然产物股份有限公司
根据前述方法制得的高稳定性甲鱼油的检测方法：称取0.1g甲鱼油样品于具塞试管中，加入2ml0.5mol/l的naoh-ch3oh溶液，充分摇匀，65℃水浴加热30min，取出后自然冷却，再加入2ml15％bf3-ch3oh溶液，充分摇匀，65℃水浴加热3min，取出后自然冷却，加入2ml正己烷提取，同时加入2ml饱和nacl溶液水洗，静止分层，取上层清液并加入1/10体积的无水na2so4去除溶液中痕量的水，将处理好的上层清液过有机相滤膜后用气相色谱仪进行脂肪酸相对含量测定；其中气相色谱的检测条件为：hp-88氰丙基色谱柱(30m×0.25mm,0.20μm)；载气：h2；不分流进样；进样量1μl；检测温度220℃；程序升温：起始柱温设定为70℃，以15℃/min升至120℃，保持1min，再以5℃/min升至175℃，保持10min；最后以5℃/min升至220℃，保持5min。
还包括挥发性风味化合物测定，其具体方法是：称取3g甲鱼油样品置于15ml顶空进样瓶中，60℃下平衡10min，并将老化好的50/30μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(dvb/car/pdms)涂层萃取头插入进样瓶顶空部分，60℃下吸附30min，取出后插入gc-ms进样口，250℃解吸3min；
其中gc条件：色谱柱为tr-35ms(30m×0.25mm,0.25μm)；载气：高纯氦气；进样口温度250℃，不分流进样；升温程序：初始温度40℃，保持3min，以5℃/min升至90℃，再以10℃/min升至230℃，保持7min；
ms条件：离子源温度200℃；电子离子源；电子能量70ev；传输线温度250℃；检测器温度280℃；质量扫描范围m/z30-500；
通过nist2.0谱库做自动检索确认分析，且仅当正反匹配度(si/rsi)均大于800(最大值为1000)的鉴定结果才予以保留；再采用峰面积归一化法求得各挥发性成分在样品中的相对百分含量。实验结果分析。
油脂av和pov主要反映其氧化程度，是判断油脂品质好坏的重要指标。av是对油脂中游离羧酸基团个数计算的一种计量标准，其数值的大小与所含游离脂肪酸量多少密切相关。av越大，表明氧化程度越高。在高温贮藏条件下，油脂受热易氧化导致其中酯键断裂而产生大量游离脂肪酸(ffa)，从而造成av过高。传统方法制备的甲鱼油(空白对照组)中av显著升高。而本发明方法制备的甲鱼油(实验组)中av增长速率缓慢，且不同添加量的作用效果也有所差异。贮藏初期，甲鱼油初始av为1.05mg/g，在高温贮藏第4d，空白对照组中av已超过鱼油行业标准sc/t3502-2016中规定的一级甲鱼油av标准8mg/g，而实验组中则在第8d才完全超过一级标准值
pov是判断油脂品质好坏的重要指标，主要反映油脂中氢过氧化物的含量。氢过氧化物是油脂氧化产生的初级氧化产物。甲鱼油长时间置于高温条件下，易导致其氧化作用加剧，pov升高。且在氧化过程中，氢过氧化物的分解速率与其生成速率之间的关系也会影响pov的变化规律。另外，氢过氧化物能被进一步分解成小分子酮、醛类等次级氧化产物。而本发明中的脂溶性天然抗氧化剂组合配方的添加能有效地减弱甲鱼油中的氧化作用，实验组的pov的变化趋势与av相似。甲鱼油中所含的不饱和脂肪酸(pufa)，在高温条件下，极易被氧化而分解、异构化，且氧化会不断进行，直至pufa中所含双键完全消失。总体来看，实验组中pov在贮藏第4d以上才会超过鱼油行业标准sc/t3502-2016中规定的一级甲鱼油的pov标准6mmol/kg，而空白组则在第2d就已超过一级标准值。
甲鱼油中挥发性成分主要由醛、醇、酮、酸和呋喃类等物质组成。醛类化合物是不良风味的重要组成成分，主要来自不饱和脂肪酸的氧化降解，可表征油脂的氧化程度。醛类的感觉阈值一般很低，对整体风味贡献大；醇类化合物是由于脂肪酸二级氢过氧化物的降解或羰基化合物还原生成，可分为饱和醇类与不饱和醇类。相比之下，不饱和醇类的感觉阈值更低，对整体风味贡献更大；酮类化合物的产生机制与醛、醇类化合物类似，主要通过油脂中氢过氧化物热氧化降解产生；而烃类化合物则可能是由于烷基自由基的自氧化作用产生，各种烃类(c8～c20)的感觉阈值通常较高，对鱼油整体风味几乎没有作用。甲鱼油中主要的挥发性风味成分主要有壬醛、己醛、苯甲醛、1-戊烯-3-醇、己醇、乙酸、丁酸、2-壬酮、2-庚酮和2,5-二甲基呋喃，在贮藏过程中，变化显著。空白组在贮藏前期，挥发性成分的含量增长速率缓慢，这与av及pov在贮藏前期的变化规律趋近；到贮藏中期，由于脂肪酸氧化加剧导致挥发性氧化产物大量增加，甲鱼油已产生较严重的脂肪酸败味，并伴随较强的腥臭味。在整个贮藏期间，壬醛的含量变化最为显著。壬醛是油酸氧化的主要特征产物，且感觉阈值为1μg/kg，对鱼油整体风味贡献很大，主要赋予甲鱼油脂肪味。1-戊烯-3-醇是鱼油中重要的不饱和醇类化合物，可作为评价鱼油氧化程度的参考化合物，且具有鱼腥味等特征风味，其含量变化也较明显。己醛含量在贮藏后期呈现指数型增长，己醛是亚油酸氧化的重要特征产物。另外，2-壬酮、2-庚酮及2,5-二甲基呋喃的含量都有明显增加，且阈值低，对鱼油整体风味贡献大。而乙酸、丁酸含量的增加可表征油脂氧化酸败剧烈程度，在贮藏后期，乙酸与丁酸的含量显著升高，说明该甲鱼油氧化酸败严重。
实验组在整个贮藏过程中，甲鱼油中10种主要挥发性化合物含量的变化趋势基本相同。在贮藏前期，各物质含量变化不明显，此时鱼油正处于氧化诱导阶段，稳定性较好，且在第4d，2,5-二甲基呋喃的含量较少，而2,5-二甲基呋喃主要是由亚麻酸分解产生的，阈值较高，对整体风味作用小。
空白组中检测出约14种重要脂肪酸，主要为c14-c22，且出峰时间在6-23min。而其中主要脂肪酸有肉豆蔻(c14:0)、十五酸(c15:0)、棕榈酸(c16:0)、十七酸(c17:0)、十七碳一烯酸(c17:1)、硬脂酸(c18:0)、油酸(c18:1)、亚油酸(c18:2cis)、花生四烯酸(c20:4)、epa和dha，sfa、mufa、pufa的总含量分别为31.02％、49.77％、19.26％。其中，c18:1cis是一种具有良好生理活性的mufa。有研究报道，长期食用富含油酸的食物能有效降低ⅱ型糖尿病患病风险，其含量最高，c16:0和dha次之，c17:1含量最少，且∑epa+dha为11.17％。
在整个贮藏期间，空白组中脂肪酸变化最为显著。贮藏后，空白组中∑sfa、∑mufa分别增加了30.05％和3.32％，而∑pufa则下降了51.11％，其中∑epa+dha减少了38.23％。鱼油中pufa较mufa更易被氧化，其减少速率比mufa快，而mufa氧化成为sfa的速率又相对较慢，故使得mufa占比增大。该结果与李文佳研究鱼油贮藏过程中脂肪酸变化的趋势相接近，即整个贮藏过程中，甲鱼油中sfa总含量增加而导致整体不饱和度下降。而实验组的甲鱼油的氧化速率明显减小，能有效地保护甲鱼油中的活性成分，最终∑epa+dha为9.04％，下降率分别仅为19.07％。