一种俄色叶提取物及其质量检测方法与流程

本发明涉及一种俄色叶提取物及其质量检测方法。

背景技术：

“俄色叶”为甘孜州藏族自治州藏族民间习用药材，来源于蔷薇科苹果属植物变叶海棠和花叶海棠的干燥叶。始载于《晶镜本草》，具有保肝利胆、除腻涤滞、攻坚化积的作用，常用于治疗消化不良、脘腹胀痛、肝疾，在该地区使用历史悠久，但目前缺乏法定标准，且化学成分、有效性均不明确。有文献对俄色叶的化学成分与功效相关性的研究，明确指标性成分。(夏冬梅，藏药“俄色叶”的质量标准研究，成都中医药大学硕士论文，2014-05-01)

对于俄色叶的指纹图谱，目前尚无相关文献报道。

技术实现要素：

本发明的技术方案是提供了一种俄色叶提取物。本发明的另一技术方案是提供了该一种检测俄色叶质量的方法。

本发明提供了一种俄色叶提取物，采用高效液相色谱检测，具有至少7个特征峰，相对保留时间分别为：峰5：0.265±5％；峰8：0.547±5％；峰9：0.570±5％；峰11：0.815±5％；峰12：1.000±5％；峰13：1.301±5％；峰14：1.394±5％；

其色谱条件为：

色谱柱为insertsilods-3(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈(a)-0.1％磷酸溶液(b)，采用梯度洗脱，洗脱程序为：0～10min，10～12％a；10～15min，12％～15％a；15～16min，15％～18％a；16～60min，18％a；60～65min，18％～22％a；65～70min，22％～25％a；70～80min，25％～30％a；80～85min，30％～40％a；85～92min，40％a；92～100min，40％～52％a；柱温30℃；检测波长340nm；进样量10μl；体积流量为1ml.min^-1。

进一步优选地，它还含有10个特征峰，相对保留时间分别为：峰1：0.143±5％；峰2：0.150±5％；峰3：0.191±5％；峰4：0.231±5％；峰6：0.304±5％；峰7：0.350±5％；峰10：0.790±5％；峰15：1.406±5％；峰16：1.416±5％；峰17：1.489±5％。

本发明提供了一种检测所述的俄色叶提取物的质量的方法，它是采用hplc方法检测，包括如下步骤：

a、供试品溶液制备：取俄色叶粉末，过筛，精密称定，加入甲醇提取，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，滤过，即得；

b、对照品溶液制备：精密称取绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、根皮苷、槲皮素、根皮素；加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀，制成相应质量浓度的混合对照品溶液；

c、分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液注入液相色谱仪，检测。

其中，a、b步骤所述的甲醇为50％甲醇。

其中，a步骤所述的提取方法为超声提取。

其中，c步骤所述的色谱条件为：色谱柱为insertsilods-3(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈(a)-0.1％磷酸溶液(b)，采用梯度洗脱，洗脱程序为：0～10min，10～12％a；10～15min，12％～15％a；15～16min，15％～18％a；16～60min，18％a；60～65min，18％～22％a；65～70min，22％～25％a；70～80min，25％～30％a；80～85min，30％～40％a；85～92min，40％a；92～100min，40％～52％a；柱温30℃；检测波长340nm；进样量10μl；体积流量为1ml.min^-1。

采用高效液相色谱方法建立了俄色叶药材的指纹图谱，确定了17个共有峰构成俄色叶药材的特征指纹图谱，根据对照品确认了特征指纹图谱中7个特征峰：5号峰为绿原酸，8号峰为金丝桃苷，9号峰为异槲皮苷，11号峰为槲皮苷，12号峰为根皮苷，13号峰为槲皮素，14号峰为根皮素。对采集的13批不同基原和年份的俄色叶药材(9批俄色叶芽，4批俄色叶)进行了相似度分析，各批药材的相似度均在0.9以上。

本发明以藏药俄色叶粉末为检测对象，构建了藏药俄色叶的指纹图谱，获得了较为全面的图谱信息，结合该指纹图谱中多个色谱峰的信息，能够全面快速的检测其质量，有利于全面质量控制和整体质量控制，从而有助于提高俄色叶使用的安全性和有效性。

用本发明所提供的方法所建立的俄色叶指纹图谱，能有效地表征俄色叶的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，即可避免因个别化学成分而判定俄色叶质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

本发明提供的俄色叶指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定性好、分离好、精密度高、重现性好、准确、快速，可用于评价俄色叶药材的质量。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图113批俄色叶hplc指纹图谱及其对照指纹图谱(r)

图2俄色叶hplc谱

具体实施方式

本实验比较了甲醇-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.1％磷酸水溶液洗脱系统，结果表明乙腈-0.1％磷酸水溶液洗脱系统分离效果较好，故选用乙腈-0.1％磷酸水溶液洗脱系统。测定了多个波长(256、286、330、340、345、350、355、360nm)的色谱图，发现俄色叶在340nm处基线平稳，出峰数目最多，色谱峰相互之间分离效果最好，且各峰形较好，故俄色叶检测波长为340nm。分别考察了0.8ml.min^-1和1ml.min^-1的体积流量，结果表明体积流量为1ml.min^-1样品的基线较平，各成分能达到很好的分离效果，因而体积流量选择1ml.min^-1。

在样品处理过程中，考察了俄色叶超声提取时间30min、45min、60min，结果表明超声45min后，延长提取时间，提取量无明显差别，故提取时间选择45min。

试验例1本发明俄色叶hplc指纹图谱建立

1色谱条件

色谱柱为insertsilods-3(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈(a)-0.1％磷酸溶液(b)，采用梯度洗脱，洗脱程序为：0～10min，10～12％a；10～15min，12％～15％a；15～16min，15％～18％a；16～60min，18％a；60～65min，18％～22％a；65～70min，22％～25％a；70～80min，25％～30％a；80～85min，30％～40％a；85～92min，40％a；92～100min，40％～52％a；柱温30℃；检测波长340nm；进样量10μl；体积流量为1ml.min^-1。

2溶液的制备

混合对照品溶液制备：精密称取绿原酸、槲皮素对照品各1mg，金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷各2mg，根皮苷10mg，根皮素5mg，置于25ml容量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度摇匀，制成相应质量浓度的混合对照品溶液。

供试品溶液制备：取俄色叶粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇25ml，称定质量，超声提取45min，放冷，再称定质量，用50％甲醇补足减失的质量，0.45μm微孔滤膜虑过，即得供试品溶液。

3方法学考察

3.1精密度试验

取俄色叶(s2)供试品溶液，按“1色谱条件”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图，计算各主要色谱峰相对峰面积rsd值在0.12％～2.06％，相对保留时间rsd值在0.02％～0.34％，表明仪器精密度良好。

3.2稳定性试验

取俄色叶(s2)供试品溶液，按“1色谱条件”项下色谱条件进行检测，分别于0h、2h、4h、8、12、24h记录色谱图，计算各主要色谱峰相对峰面积rsd值在0.28％～2.71％，相对保留时间rsd值在0.01％～0.57％，表明供试品溶液在24h内稳定。

3.3重复性试验

取同一批俄色叶(s2)供试品，按“2溶液的制备”项下供试品溶液制备方法制备6份供试品溶液，按“1色谱条件”项下色谱条件进行检测，计算各主要色谱峰相对峰面积rsd值在0.07％～2.42％，相对保留时间rsd值在0.03％～0.23％，表明方法重复性良好。

4俄色叶hplc指纹图谱的建立与分析

将收集的13批俄色叶样品按“2溶液的制备”项下俄色叶供试品溶液制备方法进行制备，并按“1色谱条件”项下色谱条件进行hplc测定，记录色谱图。

由色谱图可知，根皮苷的色谱峰分离度良好，峰型稳定，且各样品中均含有此峰，故将根皮苷作为参照峰(s)。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012a版本建立俄色叶的hplc指纹图谱，结果见图1。

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012a版，以共有模式图谱(r)为参照，计算相似度，结果见表1。俄色叶hplc指纹图谱相似度分别为0.975、0.980、0.983、0.982、0.983、0.979、0.981、0.948、0.978、0.993、0.973、0.972、0.981，相似度均在0.9以上，因此可作为俄色叶hplc指纹图谱对俄色叶样品进行比较分析研究。

表113批俄色叶hplc指纹图谱相似度评价结果

5色谱峰的指认

分别取混合对照品溶液和俄色叶样品溶液，按“1色谱条件”项下色谱条件进行hplc测定，色谱图见图2。通过与混合对照品色谱峰进行对比分析，对其中7个色谱峰进行指认定性，分别为5号峰为绿原酸，8号峰为金丝桃苷，9号峰为异槲皮苷，11号峰为槲皮苷，12号峰为根皮苷，13号峰为槲皮素，14号峰为根皮素。