一种双参数动态荧光检测系统及方法与流程

本发明涉及荧光检测系统与方法，具体地，涉及一种双参数动态荧光检测系统及方法。

背景技术：

在光学检测方法中，荧光法的固有检测灵敏度高，所需样品量少，检测限通常较其他方法低，同时包含有荧光强度、荧光寿命、量子产率、激发峰波长、发射峰波长等多种测量参数可供使用，因此应用较为广泛。目前，荧光法已经广泛应用于生化、化学、药物分析、食品检验、地理、冶金、医学、环境科学、生命科学研究等领域中。

目前基于荧光法的仪器主要有荧光分析仪和荧光分光光度计，均可以测定荧光物质的性质和含量的分析。荧光分析仪主要是针对生产过程中以及原材料中可能含有有害物质的产品进行环保检测的一种工具，一般用于工厂和海关检测。荧光分光光度计主要包括手持式、自动记录式和微机化式几种类型，就测量精度而言，前两种类型远远不及后者，且三种类型体积均偏大，不便于灵活使用。

但是，现有的荧光检测仪器均存在以下不足之处：

其一，现有的荧光检测仪器样品仓的均为属于封闭方式，只能在被测样品处于稳定状态之后送入样品仓进行检测，不仅操作过程复杂、耗时长，而且无法测量样品在反应零时刻的变化，存在初始阶段的检测盲区。这对于很多瞬间发生的生物化学反应无法做到实时、动态、快速的动态检测。

其二，现有的荧光检测仪器均为光谱式检测仪器，可调制激发光波长，可检测发射波谱。虽然可适用于多种被测物质成分，但是每次检测过程只能测量单一参数，而且系统复杂、成本高。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种双参数动态荧光检测系统及检测方法，可实现双参数同步快速检测。

根据本发明的第一个方面，提供一种双参数动态荧光检测系统，所述系统包括：光源、发射滤光片、比色皿、第一光电倍增管、第二光电倍增管、第一接收滤光片、第二接收滤光片、数据采集器，其中：

所述光源为单一的宽光谱光源；

所述发射滤光片用于产生所需波长的单色光，通过不同波长的发射滤光片产生不同窄带波长的近似单色光，用于不同物质成分的荧光激励；

所述比色皿用于盛装检测溶液，所述检测溶液是量子点缓冲液与待测溶液的混合溶液，所述量子点表面修饰了对待测物质成分具有特异性的敏感物质，所述敏感物质与待测溶液的指定物质发生化学反应；

所述光源、所述发射滤光片以及所述比色皿形成荧光激发光路，当所述光源发出单色光激励之后，经所述发射滤光片滤光后到达所述比色皿，使所述比色皿中检测溶液的所述量子点与所述敏感物质分别激发出不同波长的两种荧光信号；两种荧光信号分别经过所述第一接收滤光片、所述第二接收滤光片后到所述第一光电倍增管、所述第二光电倍增管；

所述第一光电倍增管和第一接收滤光片组成第一荧光接收光路，所述第一光电倍增管接收与所述第一接收滤光片相同波长的荧光信号，所述第一接收滤光片的波长对应其中一种所述荧光信号的波长；

所述第二光电倍增管与第二接收滤光片组成第二荧光接收光路，用于接收与所述第二接收滤光片相同波长的荧光信号，所述第二接收滤光片的波长对应于另一种所述荧光信号的波长；

所述数据采集器分别连接第一光电倍增管的输出端和第二光电倍增管的输出端，同步采集所述第一荧光接收光路和第二荧光接收光路输出的不同波长的荧光信号，实现双参数同步检测。

优选地，第一光电倍增管、第二光电倍增管对称分布在所述比色皿的两侧，第一光电倍增管和第二光电倍增管的轴线均与所述荧光激发光路呈90°角，可以同步测量两路荧光信号，或者测量一路荧光信号而另一路作为参比信号，测量模式可以自由选择。

本发明中，所述比色皿内盛装的检测溶液是量子点缓冲液与待测溶液的混合溶液，当被激发光照射后将被激发出两种不同波长的荧光信号，进而可以实现双参数同步检测。

本发明中，所述发射滤光片可以根据待测溶液的物质成分和待测参数的不同需要进行合理选择和替换，以测量不同物质成分或者不同参数的荧光强度信号。

优选地，所述系统还包括箱体，其中，所述光源、所述发射滤光片、所述比色皿、所述第一光电倍增管、所述第二光电倍增管、所述第一接收滤光片、所述第二接收滤光片、所述电源、所述数据采集器设置于所述箱体内，所述箱体通过第一隔板分为第一腔室和第二腔室，所述第一隔板具有第一通光孔，所述第一通光孔用于通光，所述光源设置于所述第一腔室，所述发射滤光片设置于所述第一隔板上，并位于所述第一通光孔处，用于滤除光源发射光中的其他波长的杂散光；

所述光源前端需要贴紧第一隔板，并对准第一隔板上的第一通光孔；所述发射滤光片安装在的第一隔板上，并对准第一隔板上的第一通光孔。

所述比色皿、所述第一光电倍增管、所述第二光电倍增管、所述第一接收滤光片、所述第二接收滤光片设置于所述第二腔室，所述第二腔室通过第二隔板和第三隔板分别形成三个腔室，所述比色皿设置于中间腔室，所述比色皿的位置对应所述光源的位置，使所述光源通过发射滤光片、所述第一通光孔与所述比色皿形成荧光激发光路；

所述第一光电倍增管、所述第二光电倍增管对称设置于所述比色皿的两侧腔室，所述第二隔板上设置有第二通光孔，所述第一接收滤光片设置于所述第二隔板上，并位于所述第二通光孔处，用于提取与所述第一接收滤光片相同波长的荧光，使所述第一光电倍增管通过第一接收滤光片和所述第二通光孔形成第一荧光接收光路；所述第三隔板上设置有第三通光孔，所述第二接收滤光片设置于所述第三隔板上，并位于所述第三通光孔处，用于提取与所述第二接收滤光片相同波长的荧光，使所述第二光电倍增管通过第二接收滤光片和所述第三通光孔形成第二荧光接收光路。

所述电源为所述光源、所述数据采集器、所述第一光电倍增管、所述第二光电倍增管供电。所述电源为高稳定度集成稳压电源，为所述光源、所述数据采集器、所述第一光电倍增管、所述第二光电倍增管提供相应的电压，并为所述第一光电倍增管、所述第二光电倍增管提供精密可调的控制电压，为所述光源提供可调电压。

将所述第一接收滤光片对准第二隔板上的第二通光孔，将所述第二接收滤光片对准第三隔板上的第三通光孔。

将所述第一光电倍增管、所述第二光电倍增管的分别正对所述比色皿所在的腔室，紧挨第二隔板和第三隔板，并分别对准第二隔板上的第二通光孔和第三隔板上的第三通光孔；所述第一光电倍增管、所述第二光电倍增管的型号完全一致，使用同一电源供电；

优选地，所述第一光电倍增管和所述第二光电倍增管对称分布在比色皿两侧，安装距离相同，参数相同，所述第一光电倍增管和所述第二光电倍增管的轴线分别与所述荧光激发光路呈90°角。

所述第一光电倍增管和所述第二光电倍增管在待测溶液放入所述比色皿之初便开始采样荧光信号，因此可以获得化学反应最初时刻及以后的荧光信号变化全过程，从而实现了动态荧光信号的最快速检测。

优选地，所述电源和所述数据采集装置设置于所述第一腔室内，所述第一腔室通过第四隔板、第五隔板形成三个腔室，所述光源设置于所述电源与所述数据采集装置之间腔室。

优选地，所述箱体为密封式箱体，所述箱体具有仪器盖，所述仪器盖用于覆盖所述箱体，所述仪器盖上设置方孔，所述方孔的位置对应所述比色皿，所述方孔的尺寸大于所述比色皿的尺寸，用于人工对所述比色皿进行操作，所述方孔的上方设置遮光盖。所述仪器盖可以与箱体完全紧贴，隔离各个腔室；所述方孔尺寸比所述比色皿略大，所述方孔正对比色皿放置处，便于人工对所述比色皿进行操作；所述仪器盖设置有一小遮光盖，可以直接盖在所述比色皿上方，用于遮挡环境光的干扰。

优选地，所述箱体和所述仪器盖的内表面设置为黑色亚光面，用于减小杂散光的干扰。可以为黑色哑光喷漆、黑色遮光布贴敷等。

优选地，所述比色皿为四面通光的石英比色皿。安装时需要将所述石英比色皿的狭缝一侧正对所述光源所在的腔室。

优选地，所述电源为集成稳压电源，所述第一光电倍增管和所述第二光电倍增管的控制电压可直接由所述集成稳压电源上的精密电位器进行精密调节，控制电压的大小决定了光电倍增管的电压放大倍数，通过调节此电压可以精密地调节输出信号的大小。

优选地，所述数据采集器将采集的模拟电压信号转换为数字信号，传输至上位机。

优选地，所述上位机处理数据采集卡传来的数据，通过计算得到所需的参数。

优选地，所述光源为紫外灯，所述紫外灯的波长为300nm～500nm。所述光源为具有一定波长宽度的紫外灯，亮度和照射时间可以进行调节，以调整输出的荧光强度信号和照射时间，达到合理的激发光条件。

优选地，所述第一接收滤光片和所述第二接收滤光片，分别具有不同的波长，可以根据待测溶液的物质成分和待测参数的激发荧光的中心波长进行合理选择和替换，用以测量不同物质成分或者不同参数的荧光信号。

优选地，所述数据采集器为双路高速同步数据采集器，用以同步采集所述第一光电倍增管和所述第二光电倍增管输出的不同波长的荧光信号，实现双参数同步检测。

本发明上述系统的工作原理如下：首先将经过表面修饰的量子点缓冲液放入比色皿中，打开光源，等待一段预热稳定时间；然后待测液放入比色皿之中，来自光源的激发光照射到比色皿中的液体，量子点将被激发出一种波长的荧光，而量子点表面的修饰物与被测溶液的指定物质发生化学反应，并激发出另一种不同波长的荧光。两种不同波长的荧光信号分别透过第一接收滤光片和第二接收滤光片之后分别被第一光电倍增管和第二光电倍增管接收，第一光电倍增管和第二光电倍增管测量荧光的强度并输出相应的模拟信号，两路模拟信号由同一数据采集器同步采集并转为数字信号，并同时传输至上位机进行后续处理，最终可以同时得到两个参数的测量结果。

根据本发明的第二方面，提供一种双参数动态荧光检测方法，所述方法包括：

根据待测溶液的物质成分以及待测参数性质，选择激发光的波长，并选用中心波长与之相匹配的发射滤光片；

根据待测溶液误差成分及待测参数性质，选择量子点材料，配置成缓冲液，加注到比色皿之中；

根据待测溶液误差成分及待测参数性质，以及所述激发光波长和量子点材料特性，选择与激发的两种荧光波长对应的第一接收滤光片、第二接收滤光片；

通过数据采集器连续同步采集的第一光电倍增管和第二光电倍增管输出的荧光强度信号，并分别取平均值fa0和fb0作为两路荧光信号的初始值；

再将待测溶液加注到所述比色皿之中，将遮光盖盖好，连续同步采集的所述第一光电倍增管和所述第二光电倍增管输出的荧光强度信号，并分别取平均值fa和fb作为两路荧光信号的测量值；

分别将两个测量值与各自的初始值相比得到fa/fa0和fb/fb0，最终得到两个参数的测量结果。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明可实现双参数同步快速检测，可检测反应初期及以后的动态荧光变化全过程，针对很多瞬间发生的生物化学反应可做到实时、动态、快速的动态检测，克服了现有技术中荧光检测仪器只能在被测样品处于稳定状态之后送入样品仓进行检测，不仅操作过程复杂、耗时长，而且无法测量样品在反应零时刻的变化，存在初始阶段的检测盲区。

通过本发明实现了双参数同步检测，相比于现有现有的荧光检测仪器每次检测过程只能测量单一参数，而且系统复杂、成本高；而本发明的装置体积小，重量轻。

本发明用于生物化学检测过程，有助于分析细胞代谢全过程的变化情况，也可以用于其他的生物化学检测过程。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明一优选实施例中荧光检测系统平面组成示意图；

图2为本发明一优选实施例中箱体结构示意图；

图3为本发明一优选实施例中荧光检测系统内部布局三维示意图；

图4为本发明一优选实施例中荧光检测系统仪器盖示意图；

图中标记分别表示为：箱体1、光源2、发射滤光片3、比色皿4、第一光电倍增管5a、第二光电倍增管5b、第一接收滤光片6a、第二接收滤光片6b、电源7、数据采集器8、仪器盖9、遮光盖10、第一隔板11、第一通光孔12、第二隔板13、第二通光孔14、第三隔板15、第三通光孔16。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例：

如图1-3为本发明一种双参数动态荧光检测系统中一优选实施例的结构示意图，如图1所示，图中包括有：箱体1、光源2、发射滤光片3、比色皿4、第一光电倍增管5a、第二光电倍增管5b、第一接收滤光片6a、第二接收滤光片6b、电源7、数据采集器8、仪器盖9、遮光盖10。

如图1、图3所示，本发明一种双参数动态荧光检测装置的结构示意图，如图2所示，箱体1为密封式箱体，箱体1的内部划分为六个腔室，上部中央的腔室用来安装光源2，上部左右两侧的两个腔室分别用来安装电源7和数据采集器8，下部中央的腔室用来安装比色皿4，下部左右两侧的两个腔室对称安装两个相同规格的第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b，各腔室之间的隔板上制作有规格形状的通光孔，用于通光。

如图2所示，光源2前端需要贴紧上下中央腔室之间的第一隔板11，并对准第一隔板11上的第一通光孔12；

如图3所示，比色皿4为四面通光的石英比色皿，安装时需要将比色皿4的狭缝一侧正对光源2所在的腔室。

如图1-3所示，第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b，分别安装在比色皿4两侧的两个腔室中，第一光电倍增管5a的正对比色皿4所在的腔室，紧挨第二隔板13并对准第二通光孔14，第二光电倍增管5b的正对比色皿4所在的腔室，紧挨第三隔板15并对准第三通光孔16，第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b型号完全一致，使用同一电源7供电。

如图1所示，发射滤光片3设置于光源2所在腔室与比色皿4所在腔室之间的第一隔板11上，并对准第一隔板11上的第一通光孔12，用于滤除光源2发射光中的其他波长的杂散光。

第一接收滤光片6a设置于比色皿4所在腔室与第一光电倍增管5a所在腔室之间的第一隔板11上，并对准第一隔板11上的第一通光孔12，用于提取一定波长的荧光信号；第二接收滤光片6b设置于比色皿4所在腔室与第二光电倍增管5b的第三隔板15上，并对准第三隔板15上的第三通光孔16，用于提取一定波长的荧光信号。

电源7为高稳定度集成稳压电源，为光源2、数据采集器8、第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b提供相应的电压，并为第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b提供精密可调的控制电压，为光源2提供可调电压。

数据采集器8采集第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b输出的模拟电压信号，并转换为数字信号，传输至上位机进行数据处理和其他操作。

如图4所示：仪器盖9可以覆盖整个箱体1，并且仪器盖9可以与箱体1完全紧贴，隔离各个腔室；仪器盖9上设有一个方孔，方孔尺寸比比色皿4略大，方孔正对比色皿4的放置处，便于人工对比色皿4进行操作，仪器盖9配备有一小遮光盖10，可以直接盖在比色皿4上方，用于遮挡环境光的干扰。

本发明的荧光检测系统的工作原理如下：首先将经过表面修饰的量子点缓冲液放入比色皿4中，然后将待测液放入比色皿4之中，来自光源2的激发光照射到比色皿4中的液体，量子点缓冲液将被激发出一种波长的荧光，而量子点表面的修饰物与被测溶液的指定物质发生化学反应，并激发出另一种不同波长的荧光。两种不同波长的荧光信号分别透过第一接收滤光片6a和第二接收滤光片6b之后分别被第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b接收，第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b测量两路荧光信号的强度并相应地输出两路模拟信号，这两路模拟信号由同一数据采集器8同步采集并转为数字信号，同时传输至上位机进行后续处理，最终可以同时得到两个参数的测量结果。

例如，为了测量细胞代谢产生的ph值与溶解氧浓度两个参数，可以采用香豆素修饰的cdse量子点胶体溶液进行检测。可以取295μl被测溶液，加入5μl的香豆素修饰的cdse量子点胶体溶液，得到最终的混合溶液，装入400μl的比色皿4之中进行检测。激发光为365nm，量子点激发出的荧光中心波长约为625nm，其幅值大小可以表征ph值的大小；香豆素激发的荧光中心波长约为485nm，其幅值大小可以表征溶解氧浓度的高低；利用第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b分别测量625nm和485nm荧光信号，通过数据处理可以分别得出ph值和溶解氧两个参数。

箱体1和仪器盖9的内表面均进行黑色亚光处理，例如黑色哑光喷漆、黑色遮光布贴敷等，减小杂散光的干扰。

光源2为具有一定波长宽度的紫外灯，例如300nm～500nm；光源2的亮度和照射时间可以进行调节，以调整输出的荧光强度信号和照射时间，达到合理的激发光条件。

比色皿4内盛装的溶液是量子点缓冲液与待测溶液的混合溶液，当被激发光照射后将被激发出两种不同波长的荧光信号，进而可以实现双参数同步检测；例如上述的400μl被测溶液与香豆素修饰的cdse量子点胶体混合溶液，在波长365nm光的激励下，量子点激发出的荧光中心波长约为625nm，香豆素激发的荧光中心波长约为485nm，利用两个光电倍增管5a和5b分别测量625nm和485nm荧光信号，通过数据处理可以分别得出ph值和溶解氧两个参数。

第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b的控制电压可直接由电源7上的精密电位器进行精密调节。此控制电压的大小决定了光电倍增管5a和5b的电压放大倍数，通过调节此电压可以精密地调节输出信号的大小。

第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b对称分布在比色皿4的两侧，安装距离相同，参数相同，第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b的轴线均与光源2的光路呈90°角，可以同步测量两路荧光信号，或者测量一路荧光信号而另一路作为参比信号，测量模式可以自由选择。

本发明在具体实施的过程中，发射滤光片3可以根据待测溶液的物质成分和待测参数的不同需要进行合理选择和替换，以测量不同物质成分或者不同参数的荧光强度信号。

例如：对于上述待测混合溶液，激法光的中心波长为365nm，则发射滤光片3的中心波长取为365nm。

第一接收滤光片6a和第二接收滤光片6b，分别具有不同的中心波长，可以根据待测溶液的物质成分和待测参数的激发荧光的中心波长进行合理选择和替换，以测量不同物质成分或者不同参数的荧光强度信号。例如：对于上述混合溶液，在波长365nm光的激励下，激发出的两种荧光中心波长分别为625nm和485nm，因此第一接收滤光片6a和第二接收滤光片6b的中心波长分别取为625nm和485nm，分别用于测量ph值和溶解氧两个参数。

第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b在待测溶液放入比色皿4之初便开始采样荧光信号，因此可以获得化学反应最初时刻及以后的荧光信号变化全过程，从而实现了动态荧光信号的最快速检测。

数据采集器8为双路高速同步数据采集器，可以同步采集第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b输出的不同波长的荧光信号，进而实现双参数同步检测。

本发明提供一种荧光检测系统的设计与处理方法，可以应用荧光检测系统，方法包括：

(1)根据待测溶液的物质成分以及待测参数性质，选择激发光的中心波长，并选用中心波长与之相适宜的窄带发射滤光片3，将发射滤光片3安装到光源2所在腔室与比色皿4所在腔室之间的第一隔板11上，并对准第一隔板11上的第一通光孔12。例如：上述混合溶液，选择激发光波长为365nm，发射滤光片3的中心波长也为365nm；

(2)根据待测溶液误差成分及待测参数性质，选择适宜的量子点材料，配置成浓度适宜的缓冲液，利用加注到比色皿4之中。例如：上述400μl混合溶液即为395μl被测溶液与5μl香豆素修饰的cdse量子点胶体混合而成；

(3)根据待测溶液误差成分及待测参数性质，以及前面选用的激发光波长和量子点材料特性，选择与两种荧光波长对应第一接收滤光片6a和第二接收滤光片6b，分别安装在比色皿4所在腔室与第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b所在腔室之间的第二隔板13和第三隔板15上，并分别对准第二通光孔14、第三通光孔16。例如：上述混合溶液，第一接收滤光片6a的中心波长625nm和第二接收滤光片6b的中心波长485nm；

(4)打开电源7的开关，检测系统上电，然后预热一段时间，使得检测系统趋于稳定；

(5)打开数据采集器8，连续同步采集一系列的第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b输出的荧光强度信号，并分别取平均值fa0和fb0作为两路荧光信号的初始值；

(6)将待测溶液加注到比色皿4之中，将遮光盖10盖好，连续同步采集一系列的第一光电倍增管5a和第二光电倍增管5b输出的荧光强度信号，并分别取平均值fa和fb作为两路荧光信号的测量值；

(7)分别将两个测量值与各自的初始值相比，得到fa/fa0和fb/fb0，即为两个参数ph值和溶解氧的测量结果。

该系统采用单一的宽光谱光源作为激发光，通过更换不同波长的高性能滤光片产生不同窄带波长的近似单色光，满足不同物质成分的荧光激励需求。采用量子点溶液作为缓冲液，量子点表面修饰了对待测物质成分具有特异性的敏感物质。当单色光激励之后，量子点与敏感物质分别激发出波长不同的两种荧光。通过两个独立的光电倍增管分别检测两种不同波长的荧光强度，从而可以实现两种参数的同步测量。由于生物化学反应是在缓冲液中进行的，两个光电倍增管可以实时检测激发荧光的全过程，从而可以获得两个参数对应的荧光动态变化规律，进而可以在最短的时间内获得两个参数的测量结果，而不必等待荧光信号稳定之后在进行测量，其检测速度与效率可以得到成倍提高。

与现有技术相比，本发明的收益效果是：该装置体积小，重量轻，可实现双参数同步快速检测，可检测反应初期及以后的动态荧光变化全过程。这将有助于分析细胞代谢全过程的变化情况，并可用于其它生物化学检测过程。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。