一种胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)检测试剂盒及生产工艺的制作方法

本发明涉及一种胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒，属于诊断试剂盒
技术领域：
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背景技术：
：胃蛋白酶是一种消化性蛋白酶，由胃部中的胃粘膜主细胞所分泌，功能是将食物中的蛋白质分解为小的肽片段。胃蛋白酶原(pg)是胃液中胃蛋白酶的无活性前体，分为pgⅰ和pgⅱ，胃蛋白酶原经胃酸或者胃蛋白酶刺激后形成胃蛋白酶。pgⅰ来源于胃底腺的主细胞和颈粘液细胞，pgⅱ则来源与全胃腺(胃贲门腺、胃底腺、胃窦幽门腺)和远端十二指肠brunner氏腺，前列腺和胰腺也产生少量pgⅱ，胃黏膜合成的pgⅱ约为总量的25％。合成后的pg大部分进入胃腔，在酸性胃液作用下活化成胃蛋白酶，只有少量(约1％)pg透过胃粘膜毛细血管进入学循环。血清pg水平反应了不同部位胃粘膜的形态和功能。pgⅰ是检测胃泌酸腺细胞功能的指针，pgⅰ升高意味着胃酸分泌增多，pgⅰ的降低意味着胃酸分泌减少或胃粘膜腺体萎缩。pgⅱ与胃底粘膜病变的相关性较大(相对于胃窦粘膜)，其升高与胃底腺管萎缩、肠上皮化生或假幽门腺化生、异型增生有关。pgⅰ/pgⅱ比值进行性降低与胃黏膜萎缩进展相关。联合测定胃蛋白酶原pgⅰ和pgⅰ/pgⅱ比值可以代替胃底腺粘膜“血清学活检”的作用。是检查手段的革命(定量检测，减少活检痛苦和防止组织取样错漏)。目前现有技术中对于胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)的测定需要比较复杂的配液过程，并且存放时间受环境条件影响较大，长期存放的稳定性差，灵敏度差，测量重复性低。技术实现要素：为克服现有技术的不足，本发明提出一种胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒，即开即用，无需配制，检测灵敏度高，测量重复性好，并且长期存放的稳定性较好。为实现上述目的，本发明的一种胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒包括彼此独立的试剂r1和试剂r2，其中：试剂r1包括如下成分：试剂r2包括如下成分：进一步地，试剂r1包括如下成分：试剂r2包括如下成分：进一步地，在试剂r2中，胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体与羧基胶乳微球偶联，羧基胶乳微球的粒径为20nm～500nm。进一步地，羧基胶乳微球的粒径为220nm。进一步地，在试剂r2中，胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体采用抗人类胃蛋白酶原ⅰ(小鼠)单克隆抗体。进一步地，在试剂r2中，表面活性剂包括聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚、乙氧基化脂肪酸甲酯的磺酸盐。进一步地，试剂r1与试剂r2的体积比为27:5。本发明检验血清胃蛋白酶原ⅰ的原理是：样品中的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)和被乳状液粒吸附的抗体发生抗原抗体反应，即通过使用与抗体共价结合的胶乳颗粒予以增强免疫沉淀反应，形成免疫复合物。在波长700nm处检测浊度的变化，浊度的变化程度与样品中胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)的含量成正比，通过计算得出样品中的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)含量。三羟甲基氨基甲烷缓冲液作为一种生物缓冲剂，为反应提供稳定的、适宜的ph环境。氯化钠提供一个离子环境，同时能够增加试剂中盐离子效应。聚乙二醇20000是环氧乙烷水解产物的聚合物，属于一种非离子型的水溶性聚合物，具有水溶性、不挥发性、生理惰性、温和性等特性，作为分散剂和乳化剂，提高配制溶液和反应体系的均匀性和稳定性，提高抗原抗体结合物的反应浊度，提高试剂的灵敏度。吐温20是一种表面活性剂，配合聚乙二醇20000，能够增加乳化剂的稳定性，提高反应体系的反应效率。海藻糖是生物活性物质的稳定剂和保护剂，可以提高胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体和胶乳微球偶联复合物的结合效率和稳定性。叠氮化钠作为防腐剂能够防止溶液中微生物生长，保持试剂的稳定性。聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚作为一种低泡性表面活性剂，分散于各种原料中，具有良好的润湿性、渗透性。乙氧基化脂肪酸甲酯的磺酸盐具有极佳的分散力，是一种乳化、分散、净洗、耐碱各项指标均衡的全能型表面活性剂。胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体可以与血清样本中的胃蛋白酶原ⅰ特异性结合形成抗原抗体复合物，通过测定复合物的反应浊度可以计算出样本中胃蛋白酶原ⅰ的浓度。本发明还提出一种胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒的生产工艺，包括以下步骤：s1：配制试剂r1，精确称量试剂r1的各组分，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质；s2：以50mmol/l的mes缓冲液溶解胶乳微球活化剂，配制710mg/ml的胶乳微球活化剂，在聚苯乙烯胶乳微球中加入胶乳微球活化剂进行活化，在25℃下搅拌反应45min，得到活化的胶乳微球溶液；s3：以50mmol/l的mes缓冲液稀释胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体，将胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体稀释液缓慢滴加到步骤s2中制得的胶乳微球溶液中，在25℃下搅拌反应2h，制得偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；s4：在步骤s3中制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入规定量的表面活性剂、防腐剂、稳定剂、缓冲液，混匀搅拌2h后制得试剂r2；s5：对试剂r1和试剂r2分别进行半成品检验；s6：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂r1和试剂r2；s7：包装，成品检验，入库存储。进一步地，在步骤s3中，向制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入50g/l的封闭剂，在25℃下封闭60min。进一步地，步骤s1～步骤s4和步骤s6均在十万级净化车间内进行。在步骤s3中未偶联的游离抗体不需要通过高速离心机多次离心去除，仅需通过特殊的封闭处理即可实现试剂的稳定，大大简化了操作步骤，减小了包被的批间差，提高了包被效率。本发明的一种胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒，即开即用，无需配制，检测灵敏度高，测量重复性好，并且长期存放的稳定性较好。附图说明下面结合附图对本发明作进一步描写和阐述。图1是本发明首选实施方式的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒的标准曲线；图2是本发明首选实施方式的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒的测定值与理论值的线性范围示意图；图3是本发明首选实施方式的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒的测定值与理论值的样本相关性示意图。具体实施方式下面将结合附图、通过对本发明的优选实施方式的描述，更加清楚、完整地阐述本发明的技术方案。实施例1：胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒的生产，包括以下步骤：s1：对试剂r1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：s2：以50mmol/l的mes缓冲液溶解胶乳微球活化剂，配制710mg/ml的胶乳微球活化剂，在10g聚苯乙烯胶乳微球中加入6ml胶乳微球活化剂进行活化，在25℃下搅拌反应45min，得到活化的胶乳微球溶液；s3：以50mmol/l的mes缓冲液稀释胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体，制得2mg/ml的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体稀释液，将胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体稀释液缓慢滴加到步骤s2中制得的胶乳微球溶液中，控制胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体与聚苯乙烯胶乳微球质量比为0.03:1，在25℃下搅拌反应2h，制得偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；s4：向制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入50g/l的封闭剂，在25℃下封闭60min；s5：在步骤s4中制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入体积分数为2.5ml/l的聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚、体积分数为2.5ml/l的乙氧基化脂肪酸甲酯的磺酸盐、1g/l的叠氮化钠、40g/l的海藻糖、3.0285g/l的三羟甲基氨基甲烷缓冲液至终体积为1l，混匀搅拌2h后制得试剂r2；s6：对试剂r1和试剂r2分别进行半成品检验；s7：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂r1和试剂r2；s8：包装，成品检验，入库存储。其中步骤s1～步骤s4和步骤s6均在十万级净化车间内进行。实施例2：胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒的生产，包括以下步骤：s1：对试剂r1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：s2：以50mmol/l的mes缓冲液溶解胶乳微球活化剂，配制710mg/ml的胶乳微球活化剂，在0.33g聚苯乙烯胶乳微球中加入0.2ml胶乳微球活化剂进行活化，在25℃下搅拌反应45min，得到活化的胶乳微球溶液；s3：以50mmol/l的mes缓冲液稀释胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体，制得2mg/ml的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体稀释液，将胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体稀释液缓慢滴加到步骤s2中制得的胶乳微球溶液中，控制胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体与聚苯乙烯胶乳微球质量比为0.03:1，在25℃下搅拌反应2h，制得偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；s4：向制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入50g/l的封闭剂，在25℃下封闭60min；s5：在步骤s4中制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入体积分数为1ml/l的聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚、体积分数为1ml/l的乙氧基化脂肪酸甲酯的磺酸盐、0.1g/l的叠氮化钠、10g/l的海藻糖、1g/l的三羟甲基氨基甲烷缓冲液至终体积为1l，混匀搅拌2h后制得试剂r2；s6：对试剂r1和试剂r2分别进行半成品检验；s7：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂r1和试剂r2；s8：包装，成品检验，入库存储。其中步骤s1～步骤s4和步骤s6均在十万级净化车间内进行。实施例3：胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒的生产，包括以下步骤：s1：对试剂r1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：s2：以50mmol/l的mes缓冲液溶解胶乳微球活化剂，配制710mg/ml的胶乳微球活化剂，在33g聚苯乙烯胶乳微球中加入20ml胶乳微球活化剂进行活化，在25℃下搅拌反应45min，得到活化的胶乳微球溶液；s3：以50mmol/l的mes缓冲液稀释胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体，制得2mg/ml的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体稀释液，将胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体稀释液缓慢滴加到步骤s2中制得的胶乳微球溶液中，控制胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体与聚苯乙烯胶乳微球质量比为0.03:1，在25℃下搅拌反应2h，制得偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；s4：向制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入50g/l的封闭剂，在25℃下封闭60min；s5：在步骤s4中制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入体积分数为5ml/l的聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚、体积分数为5ml/l的乙氧基化脂肪酸甲酯的磺酸盐、10g/l的叠氮化钠、100g/l的海藻糖、10g/l的三羟甲基氨基甲烷缓冲液至终体积为1l，混匀搅拌2h后制得试剂r2；s6：对试剂r1和试剂r2分别进行半成品检验；s7：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂r1和试剂r2；s8：包装，成品检验，入库存储。其中步骤s1～步骤s4和步骤s6均在十万级净化车间内进行。实施例4：胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒的生产，包括以下步骤：s1：对试剂r1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：s2：以50mmol/l的mes缓冲液溶解胶乳微球活化剂，配制710mg/ml的胶乳微球活化剂，在33g聚苯乙烯胶乳微球中加入20ml胶乳微球活化剂进行活化，在25℃下搅拌反应45min，得到活化的胶乳微球溶液；s3：以50mmol/l的mes缓冲液稀释胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体，制得2mg/ml的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体稀释液，将胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体稀释液缓慢滴加到步骤s2中制得的胶乳微球溶液中，控制胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体与聚苯乙烯胶乳微球质量比为0.03:1，在25℃下搅拌反应2h，制得偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；s4：向制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入50g/l的封闭剂，在25℃下封闭60min；s5：在步骤s4中制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入体积分数为5ml/l的聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚、体积分数为5ml/l的乙氧基化脂肪酸甲酯的磺酸盐、10g/l的叠氮化钠、100/l的海藻糖、10g/l的三羟甲基氨基甲烷缓冲液至终体积为1l，混匀搅拌2h后制得试剂r2；s6：对试剂r1和试剂r2分别进行半成品检验；s7：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂r1和试剂r2；s8：包装，成品检验，入库存储。其中步骤s1～步骤s4和步骤s6均在十万级净化车间内进行。实施例5：胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒的生产，包括以下步骤：s1：对试剂r1各组分进行称量，加入溶剂中搅拌，搅拌均匀后静置，过滤并除去杂质，其中各组分的含量如下：s2：以50mmol/l的mes缓冲液溶解胶乳微球活化剂，配制710mg/ml的胶乳微球活化剂，在0.33g聚苯乙烯胶乳微球中加入0.2ml胶乳微球活化剂进行活化，在25℃下搅拌反应45min，得到活化的胶乳微球溶液；s3：以50mmol/l的mes缓冲液稀释胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体，制得2mg/ml的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体稀释液，将胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体稀释液缓慢滴加到步骤s2中制得的胶乳微球溶液中，控制胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)抗体与聚苯乙烯胶乳微球质量比为0.03:1，在25℃下搅拌反应2h，制得偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；s4：向制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入50g/l的封闭剂，在25℃下封闭60min；s5：在步骤s4中制得的偶联胃蛋白酶原i(pgⅰ)抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入体积分数为1ml/l的聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚、体积分数为1ml/l的乙氧基化脂肪酸甲酯的磺酸盐、0.1g/l的叠氮化钠、10g/l的海藻糖、1g/l的三羟甲基氨基甲烷缓冲液至终体积为1l，混匀搅拌2h后制得试剂r2；s6：对试剂r1和试剂r2分别进行半成品检验；s7：清洗包装器具，烘干，分别灌装试剂r1和试剂r2；s8：包装，成品检验，入库存储。其中步骤s1～步骤s4和步骤s6均在十万级净化车间内进行。对比例1：胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒，与实施例1的区别在于，试剂r2中未添加聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚和乙氧基化脂肪酸甲酯的磺酸盐。对比例2：胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒，与实施例1的区别在于，试剂r2中未添加乙氧基化脂肪酸甲酯的磺酸盐。对比例3：胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒，与实施例1的区别在于，试剂r2中未添加聚氧乙烯基联苯乙烯化苯基醚。本发明的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒适用且不限于日立7060、日立7080、日立7170、日立7600、日立7180、东芝400、岛津8000、罗氏p800、雅培2000、贝克曼cx、贝克曼dx、贝克曼lx、奥林巴斯400、奥林巴斯640、奥林巴斯2700、奥林巴斯5400等全自动生化分析仪。本发明的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒检测脂肪酶活性的测定方法如下：全自动生化分析仪的波长设置为700nm，采用两点终点法。加入样本、校准液或质控品6μl，之后再加162μl试剂r1混匀，于37℃孵育3min～5min后加入30μl的试剂r2混匀，于37℃孵育约18s，读取吸光度值a1，继续孵育约4.7min，读取吸光度值a2，计算吸光度之差δa＝a2-a1。使用多点定标法，以样条函数作为计算模式绘制标准曲线，样品中的pgⅰ含量根据其吸光度值在标准曲线上算出。本发明的一种胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒性能测试如下：试验中采用的校准液和质控品均采用朗道公司的产品，校准方法采用多点定标曲线折线处理，定标数据如表1。校准曲线见图1。表1：定标数据(单位ng/ml)：浓度012.52550100200od1-23256552132526785302od2-32268549134626795305od均值-27.5262550.51335.52678.55303.5试验1：线性范围取临床高值标本，高值标本按0、1/8、1/4、2/4、3/4、1的稀释比例进行稀释，每个样品测3次，取平均值数据记录如表2。根据图2可见，本发明试剂盒的最高检测范围可达180ng/ml，判定依据r2≥0.990。表2：线性范围验证结果(单位：ng/ml)：稀释比例pgⅰ理论值pgⅰ实测均值001.11/822.525.61/44546.71/29089.63/4135132.41180182.5试验2：精密度试验1、批内精密度取一个低值的pgⅰ样品和一个高值pgⅰ样品各20次，测定本发明试剂盒的批内精密度，试验结果见表3。表3：批内精密度试验结果(单位：ng/ml)测定次数样品1样品2123.5123.4224.2122.5323.0121.3422.8126.0523.6123.7623.5123.1724.1124.1824.3121.6924.1121.31023.2122.11123.0123.61222.8123.91322.9123.81423.1123.71523.2125.01623.7125.31723.8124.11824.0124.801924.1124.92023.4124.6平均值23.52123.64sd0.50191.3316cv％2.13％1.08％2、批间精密度使用实施例1、实施例2和实施例3制得的胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒分别测定同一人的血清样品20次，数据记录如表4。表4：批间精密度试验结果(单位：ng/ml)试验3：稳定性试验1、开瓶稳定性将本发明试剂盒试剂开口放置2-8℃冰箱内，取2只高低值标本，分装放置-20℃保存，每10天取高低值各1只检测3次，取平均值记录如表5。表5：开瓶稳定性试验结果(单位：ng/ml)2、效期稳定性将本发明试剂盒放置2-8℃，取2只高低值标本，分装放置-20℃保存，每3个月取高低值各1只检测3次，取平均值记录如表6。表6：效期稳定性试验结果(单位：ng/ml)试验4：样品相关性试验取40例标本，标本浓度范围分布为低、中、高全覆盖，检测三次取平均值，记录如表7。表7：样品相关性试验结果(单位：ng/ml)综上所述，本发明的一种胃蛋白酶原ⅰ(pgⅰ)检测试剂盒，即开即用，无需配制，检测灵敏度高，测量重复性好，结果准确，并且长期存放的稳定性较好。上述具体实施方式仅仅对本发明的优选实施方式进行描述，而并非对本发明的保护范围进行限定。在不脱离本发明设计构思和精神范畴的前提下，本领域的普通技术人员根据本发明所提供的文字描述、附图对本发明的技术方案所作出的各种变形、替代和改进，均应属于本发明的保护范畴。本发明的保护范围由权利要求确定。当前第1页12