人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用的制作方法

本发明属于肝病诊断技术领域，尤其涉及人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。

背景技术：

随着人们生活水平的提高，膳食结构及生活方式的改变，非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)的发病率呈逐年上升趋势，已成为我国第一大慢性肝脏疾病以及健康查体肝酶异常的首要原因；其疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、nafld相关肝硬化及肝细胞癌。nafld不仅导致肝病残疾和死亡，还与代谢综合征、2型糖尿病及结直肠肿瘤等的高发密切相关，严重危害人民生命健康。可靠的分子标志物的发现与应用是及早发现nafld、及时采取有效措施并防止疾病进展的关键。

目前，尚乏精准诊断nafld发生发展的分子标志物。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。

优选的，所述人血浆线粒体融合蛋白2的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了编码上述技术方案所述的人血浆线粒体融合蛋白2的mfn2基因在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。

优选的，所述mfn2基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明提供了人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用，所述人血浆线粒体融合蛋白2可作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物，非酒精性脂肪性肝病患者的人血浆线粒体融合蛋白2显著降低，当人血浆中的人血浆线粒体融合蛋白2的含量小于12.49ng/ml时，表明人发生了非酒精性脂肪性肝病。

附图说明

图1为健康对照与nafld小鼠肝脏病理图；

图2为健康对照与nafld小鼠肝脏病理mfn2免疫组织化学染色；

图3为健康对照与nafld小鼠mfn2蛋白表达水平；

图4为健康对照与nafld小鼠mfn2mrna表达水平；

图5为健康对照与nafld患者mfn2蛋白表达水平；

图6为nafld患者不同肝酶水平mfn2表达水平对比分析；

图7为人mfn2蛋白roc曲线。

具体实施方式

本发明提供了人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。在本发明中，所述人血浆线粒体融合蛋白2简称mitofusin2，mfn2。

在本发明中，所述人血浆线粒体融合蛋白2的氨基酸序列如seqidno.1所示，具体如下所示：

msllfsrcnsivtvkknkrhmaevnasplkhfvtakkkingifeqlgayiqesatfledtyrnaeldpvtteeqvldvkgylskvrgisevlarrhmkvaffgrtsngkstvinamlwdkvlpsgighttncflrvegtdgheaflltegseekrsaktvnqlahalhqdkqlhagslvsvmwpnskcpllkddlvlmdspgidvtteldswidkfcldadvfvlvansestlmqtekhffhkvserlsrpnifilnnrwdasasepeymeevrrqhmerctsflvdelgvvdrsqagdriffvsakevlnariqkaqgmpegggalaegfqvrmfefqnferrfeecisqsavktkfeqhtvrakqiaeavrlimdslhmaareqqvyceemreerqdrlkfidkqlellaqdyklrikqiteeverqvstamaeeirrlsvlvddyqmdfhpspvvlkvyknelhrhieeglgrnmsdrcstaitnslqtmqqdmidglkpllpvsvrsqidmlvprqcfslnydlncdklcadfqediefhfslgwtmlvnrflgpknsrralmgyndqvqrpipltpanpsmpplpqgsltqeefmvsmvtglasltsrtsmgilvvggvvwkavgwrlialsfglygllyvyerltwttkakerafkrqfvehaseklqlvisytgsncshqvqqelsgtfahlcqqvdvtrenleqeiaamnkkievldslqskakllrnkagwldselnmfthqylqpsr。

在本发明中，与健康人相比，非酒精性脂肪性肝病患者的人血浆线粒体融合蛋白2显著降低。当人的血浆中的人血浆线粒体融合蛋白2的含量小于12.49ng/ml时，表明人发生了非酒精性脂肪性肝病。

本发明还提供了编码上述技术方案所述的人血浆线粒体融合蛋白2的mfn2基因在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用。

在本发明中，所述mfn2基因的核苷酸序列如seqidno.2所示，具体如下所示：

atgatgcagtgggagtccgagcctctgcgtcgtccgcttgggacgcgccggcggaggagtggcgcgcggaggagtggcgcgctgagacgccgctcgaagcgccgagtcgcggggcagcagaggcgtaaggagtaggcggggcgagccggctgggctcagggtccaccagctcacccgggtcgaggggcaatctgaggcgactggtgacgcgcttatccacttccctcctcccgcctccccctggggtggcgctcgctggtgacgtagtgagtgtgatggccgccgcgaggccgggaaggtgaagcgcaatgtccctgctcttctctcgatgcaactctatcgtcacagtcaagaaaaataagagacacatggctgaggtgaatgcatccccacttaagcactttgtcactgccaagaagaagatcaatggcatttttgagcagctgggggcctacatccaggagagcgccaccttccttgaagacacgtacaggaatgcagaactggaccccgttaccacagaagaacaggttctggacgtcaaaggttacctatccaaagtgagaggcatcagtgaggtgctggctcggaggcacatgaaagtggctttttttggccggacgagcaatgggaagagcaccgtgatcaatgccatgctctgggacaaagttctgccctctgggattggccacaccaccaattgcttcctgcgggtagagggcacagatggccatgaggcctttctccttaccgagggctcagaggaaaagaggagtgccaagactgtgaaccagctggcccatgccctccaccaggacaagcagctccatgccggcagcctagtgagtgtgatgtggcccaactctaagtgcccacttctgaaggatgacctcgttttgatggacagccctggtattgatgtcaccacagagctggacagctggattgacaagttttgtctggatgctgatgtgtttgtgctggtggccaactcagagtccaccctgatgcagacggaaaagcacttcttccacaaggtgagtgagcgtctctcccggccaaacatcttcatcctgaacaaccgctgggatgcatctgcctcagagcccgagtacatggaggaggtgcggcggcagcacatggagcgttgtaccagcttcctggtggatgagctgggcgtggtggatcgatcccaggccggggaccgcatcttctttgtgtctgctaaggaggtgctcaacgccaggattcagaaagcccagggcatgcctgaaggagggggcgctctcgcagaaggctttcaagtgaggatgtttgagtttcagaattttgagaggagatttgaggagtgcatctcccagtctgcagtgaagaccaagtttgagcagcacacggtccgggccaagcagattgcagaggcggttcgactcatcatggactccctgcacatggcggctcgggagcagcaggtttactgcgaggaaatgcgtgaagagcggcaagaccgactgaaatttattgacaaacagctggagctcttggctcaagactataagctgcgaattaagcagattacggaggaagtggagaggcaggtgtcgactgcaatggccgaggaga。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

nafld小鼠模型建立及mfn2表达分析

建立nafld小鼠模型：采用高脂高糖高胆固醇(highfat-highcarbohydrate-highcholesterol，hfhc)饮食建立野生型c57bl/6j小鼠非酒精性脂肪性肝病模型，并设同期正常对照饲料饮食小鼠为对照。

动物分组及处理：

表1动物分组

于16周后处死所有小鼠，对肝脏形态拍照留存对比，肝组织分别以4％中性甲醛、2.5％戊二醛固定及液氮快速冷冻后置于-80℃冰箱保存，备提取蛋白、rna。

取不同组别小鼠肝脏相同部位，约1cm×1cm×0.5cm大小组织，经固定、脱色、透明石蜡包埋、连续切片等制成4μm厚的切片，已制备好的石蜡切片室温放置30min后放置烘箱(65℃)1h后进行常规he染色，显微镜下观察肝脂肪变及炎症程度。同时利用免疫组织化学染色检测不同组别小鼠肝组织中mfn2表达情况。

结果：成功建立nafld小鼠模型，nafld小鼠肝脏外形与正常对照小鼠相比显著增大、叶间裂变小(图1，a、b)。对nafld模型小鼠及健康对照小鼠肝组织行he染色结果显示，与正常小鼠相比，nafld模型小鼠肝脏可见大泡性脂肪变、炎症细胞浸润(图1，c、d)；免疫组织化学染色，通过imagej软件分析染色区域的累积光密度值(iod)显示：nafld小鼠肝组织中mfn2iod值较对照组显著降低，p＜0.001(图2，a、b)。

实施例2

实施例1的小鼠肝脏mfn2表达分析

westernblot检测mfn2蛋白表达(mfn2蛋白的氨基酸序列如seqidno:1所示)：摄取肝组织蛋白后，nanodrop测定蛋白浓度，用ddh2o将各样品稀释呈统一浓度，向稀释后的蛋白液加入1/4体积的4×蛋白上样缓冲液，混匀后置于100℃沸水煮5分钟，-20℃冷冻，待用。

westernblot检测mfn2表达水平，以在各种组织细胞中表达相对恒定的gapdh蛋白作为参照，具体步骤：检测蛋白上样后，60v、30min后电压转换成120v，待溴酚蓝跑至分离胶底部时停止电泳。转膜后含5％脱脂奶粉溶液室温封闭1h。按照mfn2(124772，abcam)抗体说明书稀释一抗后4℃摇床过夜。tbst洗膜三次，每次10min。孵育二抗，室温1h。tbst洗膜后，使用odyssey发光显影。

实时定量pcr检测mfn2基因表达：按照常规方法提取肝脏总rna，并按takara反转录试剂盒将rna反转录成cdna。以此为模板，设计特异性引物(见表2)进行pcr扩增，依次加入反应物，反应体系如下：taq酶11μl：forwardprimer0.5μl；reverseprimer0.5μl；ddh2o6μl；cdna2μl。总体积20μl。实时定量pcr仪pcr热循环参数：96℃4min，然后三步反应：94℃30s，60℃30s，72℃30s，进行40个循环，于每个循环的第三步72℃30s收集荧光信号。

表2mfn2基因pcr引物信息

结果：westernblot检测了小鼠肝脏中mfn2及gapdh水平，结果显示：与健康对照组相比，nafld组小鼠肝组织mfn2蛋白表达水平显著降低，差异有统计学意义，p＜0.01(图3)。通过qpcr技术检测了小鼠肝脏中mfn2mrna水平，结果显示：nafld组小鼠肝脏中mfn2mrna水平亦较对照组显著降低，差异有统计学意义，p＜0.01(图4)。

实施例3

健康对照及nafld患者血浆中mfn2水平，elisa检测

对河北医科大学第三医院经腹部b超及血清生化学检查证实的nafld患者328例、健康对照113例血浆标本，采用酶联免疫吸附法(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)检测血浆mfn2水平，并进行统计学分析，logistic回归分析nafld发生的独立危险因素，通过受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，roc)评估血浆mfn2水平对nafld发生的诊断效能。

按照说明书，1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需酶标条。2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。3.样本孔中加入待测样本50μl；空白孔不加。4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。5.洗板机洗板5次。6.每孔加入底物100μl，37℃避光孵育15min。7.每孔加入终止液50μl，15min内，在450nm波长处测定各孔的od值。

结果：统计学分析显示，基于目前的病人样本量，nafld患者血浆mfn2水平显著低于健康对照组，11.22±2.14ng/mlvs14.69±2.07ng/ml，p＜0.0001(图5)；

nafld患者中肝脏酶学异常组mfn2水平显著低于肝脏酶学正常组患者mfn2水平，10.70±2.12ng/mlvs11.87±1.98ng/ml，p＜0.0001(图6)，表明随着肝损伤的加重、肝酶的异常，mfn2表达水平明显降低。

对研究结果行logistic回归分析显示：mfn2为nafld发生的独立危险因素(表3)；进一步通过roc曲线分析，当病人血浆中mfn2蛋白水平小于12.49ng/ml时，提示病人发生了nafld，曲线下面积为0.869(95％ci：0.834-0.899)，灵敏度71.3％，特异度83.2％(图7)。

表3nafld预测因素

由以上实施例可以得出，人血浆线粒体融合蛋白2可作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>河北医科大学第三医院

<120>人血浆线粒体融合蛋白2在作为诊断非酒精性脂肪性肝病的分子标志物中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>757

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

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