一种银杏叶提取物或其制剂中萜内酯类指纹图谱的构建方法与流程

本发明涉及医药检测技术领域，尤其涉及一种银杏叶提取物或其制剂中萜内酯类指纹图谱的构建方法。

背景技术：

银杏叶可补心养气，益肾润肺，健脑醒神，延年益寿，现代药理学研究表明，银杏叶具有清除氧自由基、降血脂、增强中枢神经系统功能、调节神经递质和激素水平、改善血液流变状态、抗炎、抗过敏等作用。目前银杏叶在临床上应用的有斯泰隆、金纳多、天保宁、银可络、舒血宁、络欣通，冠心酮等多种品牌的片剂、颗粒剂、注射剂，主要用于治疗各种心脑血管疾病、糖尿病、神经系统疾病和呼吸系统疾病等。

指纹图谱是指某些中药材或其制剂经适当的处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图，是一种综合的、可量化的鉴定手段。目前，以指纹图谱作为中药提取物及其制剂的质量控制方法，已成为国际共识。

高效液相色谱法是鉴别化合物和确定物质结构的常用手段之一。在药物分析中，以液相色谱具有的“指纹”特性作为药物鉴定的依据，是各国药典共同采用的方法。虽然银杏叶提取物及其制剂中主要有效成分均为黄酮苷类和萜类内酯活性物质，但是银杏叶提取物和制剂除有效成分外的其他成分，相差甚远，因此，一般采用不同的仪器、不同的液相测试条件分别进样进行测试，从而导致操作步骤繁杂，工艺简便性不足。

因此为了更好地控制银杏叶提取物及其制剂的质量，保证用药的安全性，更好的指导生产，使工艺控制更加严格合理，使消费者能全面认识产品质地，需要不断研究和摸索更有利于产品质量检测、明确具体有效成分种类和含量的方法，为全面建立银杏叶提取物及其制剂的质量控制标准提供科学依据。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种银杏叶提取物或其制剂中萜内酯类指纹图谱的构建方法，为全面建立银杏叶提取物及其制剂的质量控制标准提供科学依据。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种银杏叶提取物或其制剂中萜内酯类指纹图谱的构建方法，采用高效液相色谱法构建指纹图谱，其中高效液相色谱法的色谱条件为：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱，流动相a为甲醇，流动相b为体积浓度为0.05-0.3％的甲酸水溶液，检测器为电喷雾检测器，柱温为20-40℃；流速0.5-1ml/min，梯度洗脱。

相对于现有技术，本发明提供的银杏叶提取物或其制剂中萜内酯类指纹图谱的构建方法采用高效液相色谱法构建指纹图谱，具有以下优势：

本发明提供的指纹图谱的构建方法能在同一个高效液相色谱条件下同时测定银杏叶提取物及其制剂舒血宁注射液中5种萜内酯类化合物含量，避免了在检测中频繁更换液相条件，提高了工作效率，适合工业大生产的要求。

优选地，所述梯度洗脱的条件为：

0-20min，20％流动相a；80％流动相b；

20-25min，20％→30％流动相a；80％→70％，流动相b；

25-39min，30％→35％流动相a；70％→65％，流动相b；

39-49min，35％→75％流动相a；65％→25％，流动相b；

49-51min，75％流动相a；25％，流动相b；

51-53min，75％→40％流动相a；25％→60％，流动相b；

53-60min，40％流动相a；60％流动相b。

由于银杏叶提取物及其制剂舒血宁注射液中成分复杂，用单一流动相无法良好分离各组分，使用优选的洗脱时间及流动相比例，可以使待测溶液中性质差异较大的组分根据各自的性质、按各自适宜的容量因子k实现良好的分离。

优选地，所述高效液相色谱法的色谱条件为：固定相是以十八烷基键合硅胶为填料的色谱柱，流动相a为甲醇，流动相b为体积浓度为0.2％的甲酸水溶液，检测器为电喷雾检测器，柱温为30℃；流速0.5ml/min。

优选地，所述色谱柱的参数为250mm×4.6mm，5μm。

优选地，所述高效液相色谱法采用的进样量为2-10μl。

优选地，所述银杏叶提取物的指纹图谱有13个特征共有峰，以银杏内酯c的色谱峰为参照峰，以其保留时间为1计，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对保留时间分别如下：峰1：0.165±0.005；峰2：0.587±0.003；峰3：0.742±0.004；峰4：0.888±0.002；峰5：1.00；峰6：1.672±0.005；峰7：1.821±0.006；峰8：2.281±0.022；峰9：2.320±0.018；峰10：2.398±0.021；峰11：2.462±0.026；峰12：2.567±0.029；峰13：2.658±0.032。

优选地，所述银杏叶提取物的指纹图谱有13个特征共有峰，以银杏内酯c(s峰，峰5)的峰面积为1计，其他特征共有峰的相对峰面积应分别为1.490±0.373(峰3)、0.394±0.118(峰4)、1.649±0.412(峰6)、0.957±0.239(峰7)、0.912±0.274(峰11)、1.385±0.346(峰12)。根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》的有关规定，单峰面积占总峰面积＜5％的共有峰，峰面积比不做要求。因此1、2、8、9、10和13号峰的峰面积比值不作要求。

优选地，所述舒血宁注射液的指纹图谱有13个特征共有峰，以银杏内酯c的色谱峰为参照峰，以其保留时间为1计，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对保留时间分别如下：峰1：0.164±0.006；峰2：0.195±0.01；峰3：0.888±0.002；峰4：1.00；峰5：1.672±0.006；峰6：1.822±0.005；峰7：2.238±0.018；峰8：2.282±0.020；峰9：2.321±0.021；峰10：2.399±0.013；峰11：2.463±0.025；峰12：2.568±0.028；峰13：2.659±0.030。

优选地，所述舒血宁注射液的指纹图谱有13个特征共有峰，以银杏内酯c(s峰，峰4)峰面积为1计，其他6个共有峰的相对峰面积应分别为0.677±0.203(峰1)、0.401±0.120(峰3)、1.718±0.430(峰5)、0.981±0.245(峰6)，0.862±0.259(峰11)，1.310±0.328(峰12)。根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》的有关规定，单峰面积占总峰面积＜5％的共有峰，峰面积比不做要求。因此2、4、7-10和13号峰的峰面积比值不作要求。

优选地，以白果内酯、银杏内酯j、银杏内酯c、银杏内酯a和银杏内酯b为对照品，采用甲醇溶解，得到对照品溶液。

优选地，所述对照品溶液中白果内酯、银杏内酯j、银杏内酯c、银杏内酯a和银杏内酯b的浓度分别为0.07-0.10mg/ml、0.015-0.035mg/ml、0.05-0.08mg/ml、0.07-0.10mg/ml和0.05-0.075mg/ml。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的对照品溶液的高效液相色谱图；

图2是本发明实施例1提供的银杏叶提取物的指纹图谱；

图3是本发明实施例2提供的舒宁注射液供的指纹图谱。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本发明实施例提供一种银杏叶提取物中萜内酯类指纹图谱的构建方法：包括以下步骤：

步骤a、参考《中国药典》2015版一部银杏叶提取物中含量测定项下银杏内酯供试品溶液制备方法制备银杏叶提取物供试品溶液，具体为：精密称取银杏叶提取物130mg，加水10ml，置水浴中，温热使溶散，加2wt％盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml)，合并提取液，用5wt％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，再用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯10ml提取液及洗涤液，用水洗涤2次每次20ml，分取水液，用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至近干，残液用甲醇溶解并转移至25ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，取适量用0.45μm的微孔滤膜过滤，将得到的续滤液作为银杏叶提取物的供试品溶液。

步骤b、以白果内酯、银杏内酯j、银杏内酯c、银杏内酯a和银杏内酯b为对照品，采用甲醇溶解，得到对照品溶液，且所述对照品溶液中白果内酯、银杏内酯j、银杏内酯c、银杏内酯a和银杏内酯b的浓度分别为0.085mg/ml、0.025mg/ml、0.062mg/ml、0.082mg/ml和0.063mg/ml。

步骤c、采用高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照品溶液进行高效液相色谱分析，构建指纹图谱，其中高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为ymc-packods柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相a为甲醇，流动相b为体积浓度为0.2％的甲酸水溶液，检测器为电喷雾检测器，柱温为30℃；流速0.5ml/min，进样量为5μl，梯度洗脱，梯度洗脱条件为：

0-20min，20％流动相a；80％流动相b；

20-25min，20％→30％流动相a；80％→70％，流动相b；

25-39min，30％→35％流动相a；70％→65％，流动相b；

39-49min，35％→75％流动相a；65％→25％，流动相b；

49-51min，75％流动相a；25％，流动相b；

51-53min，75％→40％流动相a；25％→60％，流动相b；

53-60min，40％流动相a；60％流动相b。

对照品溶液的高效液相色谱色谱图如图1所示，图中峰bb为白果内酯；峰gj为银杏内酯j；峰gc为银杏内酯c；峰ga为银杏内酯a；峰gb为银杏内酯b。

采用上述的银杏叶提取物的指纹图谱的构建方法，建立10批次银杏叶提取物的高效液相谱，并采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对10批样品的指纹图谱进行合成，如图2所示，生成有13个共有峰构成的银杏叶提取物hplc指纹图谱，其中5号色谱峰为银杏内酯c。以10批样品生成的对照图谱为参照，计算相似度，相似度均大于0.90。

从图2中可以看出，所述银杏叶提取物的指纹图谱有13个特征共有峰，其中5号色谱峰为银杏内酯c，以银杏内酯c的色谱峰为参照峰，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对保留时间分别如下：峰1：0.165；峰2：0.587；峰3：0.742；峰4：0.888；峰5：1.00；峰6：1.672；峰7：1.821；峰8：2.281；峰9：2.320；峰10：2.398；峰11：2.462；峰12：2.567；峰13：2.658。

上述峰3为白果内酯，峰4为银杏内酯j，峰5为银杏内酯c，峰6为银杏内酯a，峰7为银杏内酯b，峰11为槲皮素-3-o-α-l-鼠李糖-2″-(6″-p-香豆酰基)-β-d-葡萄糖苷，峰12为山奈酚-3-o-α-l-鼠李糖-2″-(6″-p-香豆酰基)-β-d-葡萄糖苷。

试验例1银杏叶提取物的重复性试验

取同一批样品，按照实施例1所述银杏叶提取物中萜内酯类指纹图谱的构建方法中的步骤a制备6份供试品溶液，并采用与实施例1相同的的色谱条件下进行重复性考察，结果如表1和表2所示，共有峰相对保留时间及相对峰面积的rsd均小于5％，表明方法重复性良好。

表1特征共有峰相对保留时间

注：以银杏内酯c(s峰，峰5)的保留时间为1计。

表2特征共有峰相对峰面积

注：以银杏内酯c(s峰，峰5)的峰面积为1计，且其他共有峰峰面积占总峰面积小于5％，所以不再计算。

试验例2银杏叶提取物的精密度试验

取实施例1所制备的供试品溶液，并采用与实施例1相同的色谱条件，重复进样6次，进行精密度考察，考察特征共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果分别如表3和表4所示，特征共有峰相对保留时间及相对峰面积的rsd均小于5％，表明该方法精密度好。

表3特征共有峰相对保留时间

表4特征共有峰相对峰面积

注：其他共有峰峰面积占总峰面积小于5％，所以不再计算。

试验例3银杏叶提取物的稳定性试验

取实施例1所制备的供试品溶液，并采用与实施例1相同的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24h、48h进行检测，每次进样5μl，考察共有峰的相对保留时间、相对峰面积及相似度。结果如表5和表6所示，共有峰相对保留时间及相对峰面积的rsd均小于5％，表明供试品溶液48h内稳定。

表5特征共有峰相对保留时间

表6特征共有峰相对峰面积

注：其他共有峰峰面积占总峰面积小于5％，所以不再计算。

实施例2

本发明实施例提供一种舒血宁注射液中萜内酯类指纹图谱的构建方法：包括以下步骤：

步骤a、精密量取本品15ml，加稀盐酸2滴，调节ph值至2，用乙酸乙酯振摇提取4次(20ml、10ml、10ml、10ml)，合并乙酸乙酯液，用5wt％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取乙酸乙酯液，醋酸钠液再用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液及洗涤液，用水洗涤2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残液用甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为舒血宁注射液的供试品溶液。

步骤b、以白果内酯、银杏内酯j、银杏内酯c、银杏内酯a和银杏内酯b为对照品，采用甲醇溶解，得到对照品溶液，且所述对照品溶液中白果内酯、银杏内酯j、银杏内酯c、银杏内酯a和银杏内酯b的浓度分别为0.085mg/ml、0.025mg/ml、0.062mg/ml、0.082mg/ml和0.063mg/ml。

步骤c、采用高效液相色谱法分别对供试品溶液和对照品溶液进行高效液相色谱分析，构建指纹图谱，其中高效液相色谱法的色谱条件为：色谱柱为ymc-packods柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相a为甲醇，流动相b为体积浓度为0.2％的甲酸水溶液，检测器为电喷雾检测器，柱温为30℃；流速0.5ml/min，进样量为5μl，梯度洗脱，梯度洗脱条件为：

0-20min，20％流动相a；80％流动相b；

20-25min，20％→30％流动相a；80％→70％，流动相b；

25-39min，30％→35％流动相a；70％→65％，流动相b；

39-49min，35％→75％流动相a；65％→25％，流动相b；

49-51min，75％流动相a；25％，流动相b；

51-53min，75％→40％流动相a；25％→60％，流动相b；

53-60min，40％流动相a；60％流动相b。

对照品溶液的高效液相色谱色谱图如图1所示，图中峰bb为白果内酯；峰gj为银杏内酯j；峰gc为银杏内酯c；峰ga为银杏内酯a；峰gb为银杏内酯b。

采用上述舒血宁注射液的指纹图谱的构建方法，建立10批次舒血宁注射液的高效液相谱，并采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”对10批样品的指纹图谱进行合成，如图3所示，生成有13个共有峰构成的舒血宁注射液hplc指纹图谱，其中4号色谱峰为银杏内酯c。以10批样品生成的对照图谱为参照，计算相似度，相似度均大于0.90。

从图3中可以看出，所述舒血宁注射液的指纹图谱有13个特征共有峰，其中4号色谱峰为银杏内酯c，以银杏内酯c的色谱峰为参照峰，其他所述特征共有峰与所述参照峰的相对保留时间分别如下：峰1：0.164；峰2：0.195；峰3：0.888；峰4：1.00；峰5：1.672；峰6：1.822；峰7：2.238；峰8：2.282；峰9：2.321；峰10：2.399；峰11：2.463；峰12：2.568；峰13：2.659。

上述峰2为山梨醇，峰3为银杏内酯j，峰4为银杏内酯c，峰5为银杏内酯a，峰6为银杏内酯b，峰11为槲皮素-3-o-α-l-鼠李糖-2″-(6″-p-香豆酰基)-β-d-葡萄糖苷，峰12为山奈酚-3-o-α-l-鼠李糖-2″-(6″-p-香豆酰基)-β-d-葡萄糖苷。

试验例4舒血宁注射液的重复性试验

取同一批样品，按照实施例2所述舒血宁注射液中萜内酯类指纹图谱的构建方法中的步骤a制备6份供试品溶液，并采用与实施例2相同的的色谱条件下进行重复性考察，结果如表7和表8所示，共有峰相对保留时间及相对峰面积的rsd均小于5％，表明方法重复性良好。

表7特征共有峰相对保留时间

表8特征共有峰相对峰面积

注：其他共有峰峰面积占总峰面积小于5％，所以不再计算。

试验例5舒血宁注射液的精密度试验

取实施例2所制备的供试品溶液，并采用与实施例2相同的色谱条件，重复进样6次，进行精密度考察，考察特征共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果分别如表9和表10所示，特征共有峰相对保留时间及相对峰面积的rsd均小于5％，表明该方法精密度好。

表9特征共有峰相对保留时间

表10特征共有峰相对峰面积

注：其他共有峰峰面积占总峰面积小于5％，所以不再计算。

试验例6舒血宁注射液的稳定性试验

取实施例2所制备的供试品溶液，并采用与实施例2相同的色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24h、48h进行检测，每次进样5μl，考察共有峰的相对保留时间、相对峰面积及相似度。结果如表11和表12所示，共有峰相对保留时间及相对峰面积的rsd均小于5％，表明供试品溶液48h内稳定。

表11特征共有峰相对保留时间

表12特征共有峰相对峰面积

注：其他共有峰峰面积占总峰面积小于5％，所以不再计算。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。