一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的方法及检测试剂盒与流程

本发明属于免疫诊断检测领域，具体涉及一种应用流式细胞术对血小板抗体特异性进行检测的方法及检测试剂盒。

背景技术：

血小板抗体是患者在输血、妊娠或移植等过程中接触外来血小板抗原所产生的致病性抗体，可致敏血小板并使其遭到破坏，引起血小板减少，导致血小板输注无效症（plalelettransfusionrefractoriness,ptr），胎母同种异体免疫血小板减少症（foetal-maternalalloimmunethromlocytepenia,fmait），输血后紫癜（posttransfusionpurpura,ptp），以及移植相关同种异体免疫血小板减少症（transplantation-associatedalloimmunethrombocytopenia,taat）等多种病症，患者易出现淤点、瘀斑及出血等症状，严重者甚至会发生死亡。免疫性疾病患者在机体免疫系统紊乱的情况下亦可产生针对自身血小板的抗体，导致自身免疫性血小板减少症（idiopathicthrombocytopenia,itp）。血小板抗体包括hlai类抗体及抗血小板糖蛋白或hpa抗体。临床血小板相关免疫性疾病患者体内通常能检出抗hlaⅰ类抗体。但血小板更多的是由抗gp或hpa抗体等多种抗体共同作用，包括抗gpiv、抗gpⅱb/ⅲa、抗gpⅰa/ⅱa、抗gpⅰb/ⅸ、抗cd109抗体等。

流式细胞术是近些年发展起来的新技术，能够对一个样本进行多参数高通量检测，检测速度快、精度高、准确性好。cba（cytometricbeadarray）即微量样本多指标流式蛋白定量技术，是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。cba是流式细胞术的进阶版，利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒—“捕获微球-待测物-检测抗体夹心复合物”所散发的荧光，从而测定待测物的数量，这种方法对样本需求量更少，检测更快速、更准确。

目前，已有的检测血小板抗体方法和试剂盒主要针对患者体内的自身血小板抗体，即与患者血小板表面抗原结合的抗体。该检测方法主要应用在自身免疫性血小板减少症患者体内的自身血小板抗体检测，而临床血小板较少症患者大多数为同种异体免疫性疾病患者，此类患者也需要检测的是血液中或血浆中游离的血小板抗体（即非自身血小板抗体）。更进一步的，目前针对被检测者体内存在具体某种血小板特异性抗原（hpa）的抗体在临床上的检测方法更是数量稀少。根据上述情况，需要一种方法检测被检测者的血液或血浆中游离的血小板抗体，同时具体到某种hpa的抗体，且该方法需要具有特异性高、灵敏度好、操作简便、检测快速等特点。因此，研发一种快速且特异性高的血小板抗体特异性检测方法及试剂盒具有很大的必要性。。

技术实现要素：

通过本发明所述的检测方法与试剂盒，能够快速地检测出待测样本中血小板特异性抗体。

为实现上述目的，通过以下方法及步骤实验：

一种血小板抗体特异性检测方法，包括如下步骤：

血小板抗原特异性荧光微球的制备

将标记有apc荧光素的聚苯乙烯微球加入稀释好的鼠抗人抗体中，室温涡旋振荡，使抗血小板特异性糖蛋白抗体包被微球，不同的抗血小板特异性糖蛋白抗体与不同荧光强度的微球相结合，得到血小板抗原特异性荧光微球。

检测抗体的制备

用荧光素pe标记羊抗人免疫球蛋白多克隆抗体，即为检测抗体。

血小板对照品的制备

选择6名健康o型血志愿者，使用pcr-ssp对志愿者进行血小板hpa基因分型，分离志愿者血液中的血小板并保存。

检测反应体系：血小板抗原特异性荧光微球10μl+（血小板对照品+待测样本+血小板裂解液）30μl+检测抗体100μl

所述反应体系中，检测抗体上标记pe荧光素，将微球和检测抗体以及待测样本混合后，若存在血小板特异性抗体，就形成了“微球-抗血小板特异性糖蛋白抗体-血小板特异性糖蛋白游离抗体-pe标记的羊抗人多克隆抗体”这样的夹心复合物，通过流式测定pe荧光强度，以及已知分型血小板对照，即可判断血小板抗体特异性并确定被检测者体内血小板特异性抗体的hpa类型。

待测样本检测

通过流式细胞仪检测待测样本复合物pe通道的荧光强度mfi，以及已知分型血小板对照，即可检测血小板抗体特异性。

本发明的另一目的在于提供一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的检测试剂盒，技术方案如下：

一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的检测试剂盒，包括由不同的抗血小板特异性糖蛋白抗体包被在不同的荧光微球表面得到的血小板抗原特异性荧光微球、微球缓冲液、血小板标准品、血小板裂解液、校准微球以及检测抗体。其中校准微球用于调整fsc和ssc，得到微球群。

所述血小板抗原特异性荧光微球：包括以抗血小板特异性糖蛋白gpiv抗体包被在荧光微球a的表面，得到的血小板抗原特异性荧光微球1；以抗血小板特异性糖蛋白gpⅱb/ⅲa抗体包被在荧光微球b的表面，得到的血小板抗原特异性荧光微球2；以抗血小板特异性糖蛋白gpⅰa/ⅱa抗体包被在荧光微球c的表面，得到的血小板抗原特异性荧光微球3；以抗血小板特异性糖蛋白gpⅰb/ⅸ抗体包被在在荧光微球d的表面，得到的血小板抗原特异性荧光微球4；和以抗血小板特异性糖蛋白cd109抗体包被在荧光微球e的表面，得到的血小板抗原特异性荧光微球5。

所述血小板标准品，是由6名o型血健康志愿者提供的血液中提取的已经通过pcr-ssp进行血小板hpa基因分型的血小板。

本发明技术方案，具有如下优点：

（1）本发明所述的血小板抗体特异性检测方法，先将血小板标准品与待测样品进行孵育，使待测样品中的血小板抗体可以与血小板对照品充分结合，然后裂解血小板，使不同的抗血小板特异性糖蛋白抗体包被在不同的荧光微球表面获得的血小板抗原特异性荧光微球与裂解液中的抗体结合，然后加入pe标记的羊抗人多克隆抗体。若被检测者体内存在血小板特异性抗体，则会形成“微球-抗血小板特异性糖蛋白抗体-血小板特异性糖蛋白游离抗体-pe标记的羊抗人多克隆抗体”的复合结构，表现出荧光增强，再结合已经进行hpa基因分型的血小板对照品，进而可以检测出被检测者血浆或血清中游离的血小板某hpa的抗体，检测得到的血小板抗体结果更精确，解决了现有技术中的血小板抗体检测仅针对自身血小板抗体的问题，填补了无法测定某种具体血小板特异性抗原的抗体的空白，同时所述方法样本用量少、结果更为精确、步骤简单、易操作、效率更高。

（2）本发明所述的血小板抗体特异性检测方法，所述抗血小板特异性糖蛋白抗体为抗gpiv、抗gpⅱb/ⅲa、抗gpⅰa/ⅱa、抗gpⅰb/ⅸ和抗cd109抗体；通过选择上述的抗血小板特异性糖蛋白抗体包被微球得到的血小板抗原特异性荧光微球可以实现一次性同时检测与自身血小板结合的和血浆或血清中游离的抗gpiv、抗gpⅱb/ⅲa、抗gpⅰa/ⅱa、抗gpⅰb/ⅸ、抗cd109抗体等五类血小板抗体的特异性，检测更全面，检测过程简单、准确。

附图说明

图1为本发明不同荧光强度的血小板抗原特异性荧光微球流式细胞仪分析图；

图2为本发明中通过调节fsc和ssc的得到的血小板抗原特异性荧光微球流式细胞分析图；

图3-8为本发明方法检测被检测者血小板抗体的流式细胞仪分析结果图。从上至下分别为抗gpⅱb/ⅲa、抗cd109、抗gpⅰa/ⅱa、抗gpⅰb/ⅸ、抗gpiv抗体。

具体实施方式

本发明通过以下实施例做进一步具体描述。

实施例一：血小板抗体特异性检测试剂盒

一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性的检测试剂盒，包括由不同的抗血小板特异性糖蛋白抗体包被在不同的荧光微球表面得到的血小板抗原特异性荧光微球、微球缓冲液、血小板标准品、血小板裂解液、校准微球以及检测抗体。

实施例二：一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性检测试剂盒的制备。

本实施例为血小板抗体特异性检测试剂盒的制备，按如下步骤进行：

1、微球缓冲液的制备

本实施例涉及的微球缓冲液是含有体积分数5%的fbs的pbs溶液，其配制方法是：量取50mlfbs，加入950ml、ph7.2、0.1m的pbs缓冲液中，加入0.09%nan3（w/v），混合均匀，0.45μm水系过滤膜过滤。

2、血小板抗原特异性荧光微球的制备

本发明的所有血小板抗原特异性荧光微球的制备均为将抗血小板特异性糖蛋白抗体包被在标记有apc荧光素的羧基化聚苯乙烯微球，其方法与反应体系相同，故此实施方式以抗cd109抗体特异性荧光微球的制备为例。具体实施方式如下：

2.1溶液配制

2.1.1buffera的配制：称取0.96gnah2po4•2h2o，加h2o600ml溶解，调节ph值至6.0，再加h2o定容至800ml，用0.45μm水系过滤膜过滤；

2.1.2bufferb的配制：称取甘氨酸7.5g，加h2o800ml溶解，调节ph值至7.5，再加h2o定容至1000ml，用0.45μm水系过滤膜过滤；

2.1.350mg/ml1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）溶液配制：称取1gedc，加入50mlh2o溶解，用0.45μm水系过滤膜过滤；

2.1.450mg/mln-羟基琥珀酰亚胺（nhs）溶液配制：称取1gnhs，加入50mlh2o溶解，用0.45μm水系过滤膜过滤；

2.2微球包被

2.2.1取1ml标记有apc荧光素的羧基化聚苯乙烯微球a悬浊液，加入离心管中，10000rpm离心5分钟，弃上清；

2.2.2取80μl的buffera洗涤微球a，10000rpm离心5分钟，弃上清，重复两次；

2.2.3加入80μlbuffera于离心管管底，超声60秒；

2.2.4分别取10μledc和nhs溶液，加入到微球a悬浊液中，暗室孵育20分钟；

2.2.510000rpm离心5分钟，弃上清；

2.2.6使用500μlbufferb洗涤微球a，10000rpm离心5分钟，弃上清，重复两次；

2.2.7使用500μlbufferb重悬微球a；

2.2.8将抗cd109抗体加入微球a溶液中，抗体浓度约为200μg/ml，25℃避光孵育3小时，0.01mpbs/tween洗涤3次，并用5％(v/v)牛血清震荡封闭2h，0.01mpbs/tween洗涤3次，微球缓冲液重悬微球，配制成抗体浓度为0.15mg/ml的溶液，保存。

3、血小板标准品的制备

采血前使用血细胞计数仪计数志愿者血小板，根据血小板计数，采集外周静脉血，保证血液中至少含有1×108个血小板。200×g离心10分钟，吸取上层含血小板血浆，转移至离心管，3000rpm离心2分钟，取沉淀，ph6.2，0.05m的柠檬酸钠洗涤5次，重悬保存。

4、检测抗体的制备

本发明的检测抗体为pe荧光素标记的多克隆抗体，具体实施方式如下。

将2mg活化处理的多抗与7mg活化处理过的荧光素pe，混合于ph6.0的0.1mpbs缓冲液中，体积为1.5ml，同时加入苯胺0.137ml苯胺，混匀后，置于旋转混合仪上室温避光孵育2小时；用akta蛋白纯化仪进行纯化，用0.5倍柱体积的超声脱气纯化水进行平衡，流速为0.5ml/min，再用约1.5倍柱体积的洗脱缓冲液平衡，流速为0.5-1ml/min，上样，后用洗脱缓冲液洗脱，收集所需峰值附近液体，使用紫外可见分光光度计检测抗体浓度和抗体量，得到检测抗体。

实施例三：一种应用流式细胞术检测血小板抗体特异性检测方法。

本实施例为血小板抗体特异性检测方法，按如下步骤进行：

1、混合微球

1.1将每个试剂盒中的抗原特异性荧光微球取出，充分混匀，防止微球沉淀。

1.2根据样本数量吸取每种血小板抗原特异性荧光微球，混入一个离心管中。

1.3将混合后的抗原特异性荧光微球200×g离心5分钟。

1.4小心吸去上清。

1.5加入体积为325μl微球缓冲液。

1.6室温避光孵育30分钟。

2、待测样本准备

检测样本为血清或血浆。

2.1血清：标准试管或者有分离胶的试管采集静脉血，4000rpm离心20分钟。

2.2血浆：edta抗凝管采集静脉血，4000rpm离心20分钟。

2.3从6个血小板标准品中分别取1×108个血小板，离心弃上清，与检测样本混合，室温避光孵育2h。加入100μltris-hci血小板裂解液，混匀后震荡裂解30min，过滤后备用。

3、加入检测抗体与上机检测。

3.1取检测样本混合物30μl，加入10μl微球混合物，37℃、110rpm震荡孵育30分钟。

3.2孵育完成后，0.01mpbs洗涤三次，加入100μl检测抗体，37℃、110rpm震荡孵育30分钟。

3.3孵育完成后，0.01mpbs洗涤三次，加入0.01mpbs100μl，使用流式细胞仪进行检测。

3.4数据处理：fsc/ssc散点图圈出检测微球门，获取2500-3000个微球，通过流式细胞仪检测待测样本复合物pe通道的荧光强度mfi。

3.5数据分析：根据流式细胞仪分析结果图分析，若被检测者体内存在血小板特异性抗体，则与该抗体结合的微球表现为荧光强度升高，再结合已知hpa分型的血小板对照品作为对照，即可分析出被检测者的hpa特异性抗体分型。该实施例中被检测者样本结果图中与抗cd109抗体结合的微球荧光强度升高，说明该被检测者体内存在抗cd109抗体。同时，由于cd109糖蛋白上存在hpa15a/b抗原，从6张与不同血小板对照品结合后的结果图综合分析，与hpa分型存在15a的血小板对照品结合后的样本抗cd109抗体呈阳性，与分型为15b的血小板对照品结合后的样本抗cd109抗体呈阴性，说明该被检测者体内的血小板抗体为抗hpa15a型。