一种在线测定尿液中羟基多环芳烃的固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法的制作方法

本发明属于有机污染物分析技术领域，更具体地，涉及一种在线测定尿液中羟基多环芳烃的固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法。

背景技术：

多环芳烃(pahs)是环境中普遍存在的污染物，主要来源于化石燃料的不完全燃烧。pahs可以通过大气呼吸，膳食摄入和皮肤吸收等途径进入人体。已有研究明确指出pahs具有致癌、致畸和致突变效应，人类罹患肺癌等多种癌症与pahs的暴露密切相关。pahs在人体内的半衰期约为几小时，被人体吸收的pahs可经过肝脏等器官代谢解毒，形成羟基多环芳烃(oh-pahs)代谢物从尿液和粪便等途径排出体外。因此，可以通过检测人体尿液中的oh-pahs的含量来评估人体pahs的暴露水平和负荷。相比血液，尿液更容易采集，基质相对干净，且不受样品体积的限制，越来越多被应用于人体生物监测中。目前，已有很多文献报道了不同的方法应用于尿液中oh-pahs的分析，这些方法大多需要对尿液进行一定的前处理，比如最常见的利用离线固相萃取技术对尿液中oh-pahs进行富集和净化，方法流程繁琐，溶剂用量较大，费时低效，且不利于开展大规模的人体样品筛查。

技术实现要素：

为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，本发明目的在于提供一种在线测定尿液中羟基多环芳烃的固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法，该方法可快速检测尿样中的oh-pahs水平。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

一种在线测定尿液中羟基多环芳烃的固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法，包括如下具体步骤：

s1.取尿液样品加入同位素内标物后混匀，加入β-葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶，置于恒温摇床上在25～45℃酶解；酶解后尿液中加入有机溶剂沉淀蛋白，涡旋混匀，离心分离后取上清液，即为样品溶液；

s2.采用自动阀切换进行在线固相萃取步骤s1所得样品溶液，在线固相萃取富集柱为十八烷基硅烷化固定相色谱柱；流动相a为超纯水，流动相b为甲醇；流速为0.2～1.0ml/min；柱温为30～40℃；梯度洗脱程序从10～50％的甲醇开始，在1～2min内上升到100％的甲醇，然后下降到10～50％的甲醇，对待测目标化合物进行富集；

s3.采用液相色谱对待测富集目标化合物进行色谱分离，色谱柱为十八烷基硅烷化固定相；流动相a为0.1～1％乙酸的超纯水；流动相b为甲醇；柱温为30～40℃；流速为0.2～1.0ml/min；梯度洗脱程序开始为10～50％甲醇，然后升至100％甲醇，最后降至10～50％甲醇；然后采用三重四级杆质谱对富集目标化合物进行检测，以含有相应同位素内标的不同浓度目标化合物标准品制得工作曲线，检测得到的面积和浓度进行计算，得到各化合物的相对响应因子rrf；然后通过样品中目标化合物与内标的面积比，计算得出尿液样品中羟基多环芳烃的含量。

优选地，步骤s1和步骤s3中所述的同位素内标物为2-羟基萘-d7(2-oh-nap-d7)、¹³c6-3-羟基菲(¹³c6-3-oh-phe)、2-羟基芴-d9(2-oh-flu-d9)、1-羟基芘-d9(1-oh-pyr-d9)或3-羟基苯并[a]芘-d11(3-oh-bap-d11)中的一种以上。

优选地，步骤s1中所述尿液样品与β-葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶的体积比为(10～100)：1。

优选地，步骤s1中所述酶解的时间为1～24h。

优选地，步骤s1中所述有机溶剂为甲醇或/和乙腈。

优选地，步骤s1中所述有机溶剂和酶解后尿液的体积比为(0.1～10)：1。

优选地，步骤s1中所述的离心的速率为4000～12000rpm，所述离心的温度为4～25℃，所述离心的时间为5～30min。

优选地，步骤s3中所述的羟基多环芳烃为1-羟基萘、2-羟基萘、2-羟基芴、3-羟基芴、1-羟基菲、2-羟基菲、3-羟基菲、4-羟基菲、9-羟基菲、1-羟基芘、6-羟基3-羟基苯并[a]芘中的一种以上。

更为优选地，步骤s2中流动相a为超纯水，流动相b为甲醇，流速为0.2～1.0ml/min，柱温为30～40℃；梯度洗脱程序从10～50％的甲醇开始，确保目标化合物全部富集在富集柱上，然后六通阀自动切换，在1～2min内上升到100％的甲醇，保留3.8min直至目标化合物被洗脱至分析色谱柱，然后下降到10～50％的甲醇，保留23min；只有在此时间阶段和比例的流动相才可测试出目标化合物，这是由于当目标化合物富集时，甲醇比例太高，目标物富集不上；而当洗脱时，甲醇的比例太低，目标化合物洗脱不下来。

更为优选地，步骤s3中流动相a为0.1～1％乙酸的超纯水；流动相b为甲醇；柱温为30～40℃；流速为0.2～1.0ml/min；梯度洗脱程序开始为10～50％甲醇，保留15min，然后升至90％甲醇，保留6min，继续升至100％甲醇，保留1.5min，最后降至10～50％甲醇，保留3min；只有在此时间阶段和比例的流动相才可测试出目标化合物，这是由于当目标化合物富集时，甲醇比例太高，目标物富集不上；而当洗脱时，甲醇的比例太低，目标化合物洗脱不下来。

本发明所针对的尿液样品基质相对复杂，上仪器检测前需要进行一定的前处理，从而有效降低基质效应带来的干扰，提高方法的稳定性和可靠性；通过针对性富集和分离条件的优化，实现了对尿液中的oh-pahs进行直接的测定。相比已有的传统离线固相萃取富集的方法，在线富集的方法减少了前处理带来的分析误差，减少溶剂用量和前处理时间，更大的进样量也可以有效提升仪器灵敏度。但是当前的在线富集方法主要是针对基质相对简单的水样中目标污染物等的分析，对复杂的尿液基质中低浓度的目标物的分析报道较少。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明通过在线固相萃取-液相色谱三重四级杆质谱同位素稀释法对尿液中的oh-pahs进行分析，无需繁琐而耗时的前处理，省略了尿液样品的前处理步骤，缩短了样品分析所需时间。

2.本发明的方法大幅度减少了常规的尿液前处理所需的溶剂用量，有效降低实验室操作人员的暴露风险。

3.本发明通过同位素稀释法进行定量，有效降低了可能的基质干扰，提高了定量的准确性。

4.本发明采用在线固相萃取液相色谱-三重四级杆质谱对尿液中的oh-pahs进行分析，降低了成本，同时显著提高了样品的分析效率。

5.本发明操作简单，便于在不同实验室开展大量尿液样本的分析。

附图说明

图1为本发明在线固相萃取-高效液相色谱质谱检测系统配置图。

图2为实施例1中oh-pahs及其相应的同位素内标物的液相色谱三重四级杆质谱出峰时间和提取离子色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

实施例中尿液样品采自普通居民。所用到12种oh-pahs标准品，包括1-羟基萘(1-hydroxynaphthalene，1-oh-nap)、2-羟基萘(2-hydroxynaphthalene，2-oh-nap)、2-羟基芴(2-hydroxyfluorene，2-oh-flu)、3-羟基芴(3-hydroxyfluorene，3-oh-flu)、1-羟基菲(1-hydroxyphenanthrene，1-oh-phe)、2-羟基菲(2-hydroxyphenanthrene，2-oh-phe)、3-羟基菲(3-hydroxyphenanthrene，3-oh-phe)、4-羟基菲(4-hydroxyphenanthrene，4-oh-phe)、9-羟基菲(9-hydroxyphenanthrene，9-oh-phe)、1-羟基芘(1-hydroxypyrene，1-oh-pyr)、6-羟基(6-hydroxychrysene，6-oh-chr)、3-羟基苯并[a]芘(3-hydroxybenzo(a)pyrene，3-oh-b[a]p)。其中，1-ohnap购自accustandard(newhaven,us)，2-ohnap、2-ohflu购自chironas(trondheim,norway)，3-ohflu、9-ohflu购自torontoresearchchemicals(toronto,canada)，1-ohphe、2-ohphe、3-ohphe、4-ohphe、9-ohphe购自dr.ehrenstotfer(augsburg,germany)，1-ohpyr、6-ohchr购自accustandard(newhaven,us)，3-ohb[a]p购自torontoresearchchemicals(toronto,canada)。5种同位素内标，即2-羟基萘-d7(2-hydroxynaphthalene-d7，2-oh-nap-d7)、¹³c6-3-羟基菲(¹³c6-3-hydroxyphenanthrene，¹³c6-3-oh-phe)、2-羟基芴-d9(2-hydroxyfluorene-d9，2-oh-flu-d9)、1-羟基芘-d9(1-hydroxypyrene-d9，1-oh-pyr-d9)和3-羟基苯并[a]芘-d11(3-hydroxybenzo(a)pyrene-d11，3-oh-bap-d11)。其中，2-oh-nap-d7购自torontoresearchchemicals(toronto,canada)，¹³c6-3-oh-phe购自cambridgeisotopelaboratories(andover,us)，2-oh-flu-d9、1-oh-pyr-d9和3-oh-bap-d11购自torontoresearchchemicals(toronto,canada)。β-葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶购自roche(mannheim,germany)。

图1为本发明在线固相萃取-高效液相色谱质谱检测系统配置图。其中，1-6为六通阀，(a)为六通阀位置在1时的富集状态，1和6连通；(b)为六通阀位置在2时的分析状态，1和2连通。从图1中可知，六通阀在1(富集)位置时，待测样品经过进样阀上样，在上样泵流动相的淋洗下进入富集柱进行富集，而此时分析泵的流动相淋洗分析柱；待测样品完成富集之后，切换六通阀2(分析)位置，此时，富集在富集柱上的待测目标化合物经过上样泵的流动相的洗脱，进入第二根分析柱进行下一步分离，然后进入质谱进行检测。

实施例1

1.取500μl尿液样品放入1.5ml微型离心管，加入oh-pahs同位素内标(25ng2-oh-nap-d7、10ng2-oh-flu-d9、5ng1-oh-pyr-d9、5ng¹³c6-3-oh-phe、5ng3-oh-bap-d11)加入5μlβ-葡萄糖醛苷酶-芳基硫酸酯酶混匀，在37℃的恒温摇床上酶解12h，酶解后加入500μl乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀1min，然后进行高速冷冻离心(12000rpm，10min，4℃)，离心后取上清液进样。

2.在线固相萃取-液相色谱-三重四级杆质谱(lc-ms/ms)的型号为agilent1260-6470系列。采用自动阀切换进行在线固相萃取时六通阀连通1和6位(图1位置1)，进样体积为500μl；在线固相萃取富集柱eclipseplusc18柱(4.6×30mm×3.5μm,美国agilent公司)，具体富集过程如下：流动相a为超纯水，流动相b为甲醇，流速为1ml/min，柱温为40℃；梯度洗脱程序从10％的甲醇开始，在1.2min内上升到100％的甲醇，保留3.8min，然后下降到10％的甲醇，保留23min(参见表1中上样泵)。

表1泵参数及阀切换时间表

3.液相色谱质谱检测时六通阀连通1和2位(图1中位置2)。色谱柱为poroshell120ec-c18色谱柱(4.6×100mm×2.7μm，美国agilent公司)，保护柱为uhplcc184.6mmid；流动相a为0.1％乙酸的超纯水；流动相b为甲醇；柱温为40℃；流速为0.4l/min；梯度洗脱程序开始为50％甲醇，保留15min，然后升至90％甲醇，保留6min，继续升至100％甲醇，保留1.5min，最后降至50％甲醇，保留3min(参见表1中分析泵)。离子源为esi负模式，多反应监测(mrm)模式。干燥气温度为300℃，气体流速为5l/min，雾化器压力为45psi，鞘气温度为350℃，鞘气流速为12l/min，喷嘴电压为500v，毛细管电压为3500v。

表2尿液中oh-pahs分析的液相色谱-三重四级杆质谱参数

表2为尿液中oh-pahs分析的液相色谱-三重四级杆质谱参数。图2为oh-pahs及其相应的同位素内标物的液相色谱-三重四级杆质谱出峰时间和提取离子色谱图，从表2和图2中可知，除了1/9-oh-phe和2/3-oh-phe以外，其他oh-pahs目标物得到了基线分离。

通过液相色谱-三重四级杆质谱分析得到目标化合物(oh-pahs)及其相应同位素内标的峰面积，如表3所示。采用内标法定量，通过目标化合物(oh-pahs)及其相应的同位素内标的峰面积浓度的比值来计算相对响应因子(rrf)(表4)；然后通过rrf以及样品中oh-pahs的峰面积(表5)和内标含量计算得出尿液样品中羟基多环芳烃的含量(表6)。具体计算公示如下。

以校正标准溶液(c1～c5)进样，按式(1)计算相对响应因子(rrf值)：

rrf——目标化合物对定量内标的相对响应因子；

an——目标化合物的峰面积；

cs——定量同位素内标的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；

as——定量同位素内标的峰面积；

cn——目标化合物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/ml)；

其中，各目标化合物化合物五个浓度水平(c1～c5)的rrf值的相对标准偏差(rsd)应小于20％。按式(2)计算试样中oh-pahs的含量：

式中：

cn——目标化合物的含量，单位为纳克每毫升(ng/ml)；

an——目标化合物的峰面积；

ms——试样中加入定量同位素内标的量，单位为纳克(ng)；

as——定量同位素内标的峰面积；

rrf——目标化合物对定量内标的相对响应因子；

m——取样量，单位为毫升(ml)。

表3羟基多环芳烃及其对应的同位素内标标准曲线数据

各目标oh-pahs的化合物的检出限范围为0.006～0.12ng/ml。用稀释尿液中oh-pahs在0.04–80ng/ml的浓度梯度范围制作标准曲线，计算得到的rrf在0.06～7.14。oh-pahs的回收率为73～107％，相对标准偏差(rsd)均低于10％。

表4目标化合物的线性范围、相对响应因子及检出限

人体尿液中oh-pahs浓度如表6所示。所有的oh-pahs目标物均在样品广泛检出，表明pahs在环境中的普遍存在以及普通人群对其的广泛暴露。普通人晨尿样品中σoh-pahs的浓度范围为2.09～57.5ng/ml。各化合物的浓度按1-oh-nap>2-oh-nap>σoh-phe>2-oh-flu>3-oh-flu>1-oh-pyr的顺序递减。

表5某人体尿液中oh-pahs的峰面积响应

表6某人体尿液中oh-pahs浓度水平

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。