一种基于超高压高效液相色谱串联质谱法测定土壤中的5种硝基酚类化合物的方法与流程

本发明涉及一种硝基酚类化合物的检测方法，尤其是涉及一种基于超高压高效液相色谱串联质谱法测定土壤中的5种硝基酚类化合物的方法。

背景技术：

酚类化合物是一种中等强度的化学毒物，长期饮用含酚化合物的饮用水可引起头晕或出疹瘙痒，甚至可以致癌致突变。随着工农业的发展，酚类化合物被广泛应用，造成其在水体及土壤中残留，并且很难降解，造成一定的毒害作用。目前，在国内很多环境卫生标准都已将酚类作为控制监测项目，比如《地表水环境质量标准》(gb3838-2002)就将挥发酚和苦味酸作为监测项目，《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准》(gb36600-2018)将2,4-二氯酚、2,4,6-三氯酚、五氯酚列入控制指标；《生活饮用水卫生标准》将三氯酚和五氯酚作为检测项目。

土壤中的酚类化合物的提取以索氏提取、快速溶剂提取、超声波提取、微波提取等为主，索氏提取因其试剂耗量较大，提取时间较长，往往需要十几甚至二十几个小时，逐渐被后面几种操作方便、提取率高、提取时间短的方法所代替。而酚类化合物的仪器分析方法中，气相色谱(质谱)法是最为常用的分析方法，但气相色谱法适用于具有较好热稳定性和较好挥发性的目标化合物。而高效液相色谱法适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的目标化合物，不需要复杂的前处理步骤即可达到较高的灵敏度，所以高效液相色谱法更适合于硝基苯酚类化合物的检测。现有的高效液相色谱法检测硝基苯酚类化合物的检测方法存在土壤基质复杂，干扰多，普通高效液相色谱法对酚类测定选择性差，灵敏度低，难以精确稳定测定土壤中痕量硝基苯酚类。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测快速快、灵敏度高且准确性好的基于超高压高效液相色谱串联质谱法测定土壤中的5种硝基酚类化合物的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于超高压高效液相色谱串联质谱法测定土壤中的5种硝基酚类化合物的方法，包括以下步骤：

(1)前处理条件

a.加速溶剂萃取法：称取待测土壤样品后，加入萃取池体积70-90％的硅藻土，混匀后装入萃取池中，采用由二氯甲烷和正己烷按体积比2:1的比例混合而成的混合溶液作为溶剂，在温度100℃，压强10.3mpa下，预热5min，静态提取5min，循环2次，用萃取池体积60％的溶剂快速冲洗萃取池，氮气吹扫60s后，收集全部提取液，待做净化分析；

b.样品净化与浓缩：取步骤(1)所得的提取液中加入提取液体积2倍的纯水，用氢氧化钠溶液调节至ph>12，充分振荡，静置分层后取上层水相，将下层有机相中加入水相体积1/2的由二氯甲烷和正己烷等体积混合而成的溶剂，反萃取2～3次后弃去有机相，合并各次萃取所得水相，用盐酸溶液调节至ph<2后，加入水相体积1/2的由二氯甲烷和乙酸乙酯按体积比4：1混合而成的溶剂，振荡萃取2次，合并有机相，在自动浓缩仪上浓缩并转换溶剂，用甲醇定容至1ml后进样分析；

(2)标准曲线制作

硝基酚类化合物包括4-硝基酚，2,4-二硝基酚，2-甲基-4,6-二硝基酚，地乐酚和消螨酚5种，浓度均为10mg/l，将硝基酚混合标准溶液用由甲醇和水等体积混合而成的溶液稀释，配制成系列浓度为10、50、100、250、500μg/l的标准工作溶液，在空白土壤中分别加入上述混合标准溶液，以浓度为横坐标，仪器响应值(响应值＝标准品峰面积/标准品质量)为纵坐标，做基质加标标准曲线，作为试样处理液中待测物浓度定量的依据；

(3)色谱-质谱分析条件

色谱条件：色谱柱：thermoacquityuplcbehc18柱；流动相a：甲醇；流动相b：ph＝4.0的0.01mol/l甲酸铵-甲酸水溶液；梯度洗脱：0～0.2min，20％流动相a；0.2～3min，20％流动相a～60％流动相a；3～5min，90％流动相a；5～6min，20％流动相a，流速0.4ml/min；柱温30℃；进样量5μl；

质谱采用电喷雾负离子电离模式、多反应监测模式进行检测，质谱离子化参数：喷雾电压3200v，鞘气流量800l/h，辅助气流量6l/min，毛细管温度350℃；

(4)浓度计算方法

土壤样品中待测物的含量根据如下计算公式(1)得到：

式中：

x－试样中待测物含量，单位为μg/kg；

c－试样处理液中待测物浓度，根据基质标准曲线计算得到，单位为μg/l

v—定容体积，单位为ml；

m－试样体积或质量，单位为g。

wdm－样品干物质含量，％。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种基于超高压高效液相色谱串联质谱法测定土壤中的5种硝基酚类化合物的方法，采用二氯甲烷和正己烷的混合溶剂提取土壤中的4-硝基酚，2,4-二硝基酚，2-甲基-4,6-二硝基酚，地乐酚，消螨酚等5种硝基酚类化合物，建立了萃取-酸碱净化-超高压液相色谱串联质谱测定土壤中这5种硝基酚类化合物的方法。样品提取后能够在5min内完成仪器分析，准确定量具体的5种污染物，方法检出限达到0.002-0.008μg/kg。超高压高效液相色谱串联质谱法具备快速简便，定性准确，灵敏度高等优点，能够满足土壤、地面沉积物等环境样品中痕量硝基酚类污染物检测的要求。

附图说明

图1为5种硝基酚类在流动相甲醇—水体系ph7.0中的色谱图；

图2为5种硝基酚类在流动相甲醇—甲酸/甲酸铵体系ph4.0中的色谱图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

1、仪器与试剂

超高压液相色谱-三重四级杆质谱联用仪(watersacquitytmh-classuplc-tqd)、自动固相萃取浓缩仪、快速溶剂萃取仪(thermoase350)；

乙腈(ch3cn)、甲醇(ch3oh)、甲酸(hcooh)和甲酸铵(ch3coonhd4)均为色谱纯(fisherchemical)；超纯水(电阻率满足18.25mω·cm)；滤膜(0.22μm，聚醚砜或醋酸纤维滤膜)；0.22μm的聚四氟乙烯滤膜(津隆公司)

2、基于超高压高效液相色谱串联质谱法测定土壤中的5种硝基酚类化合物

2.1模拟土壤样品的制备

按照实验方法进行大量试验，选取其中5种硝基酚类化合物(4-硝基酚，2,4-二硝基酚，2-甲基-4,6-二硝基酚，地乐酚，消螨酚)含量低于实验方法检出限的土壤样品作为空白土壤样品。取空白土壤样品冷冻干燥后，再在内烘箱120℃条件下，加热4h，放入干燥器，备用。在空白土壤样品中加入5种硝基酚类化合物混合标准溶液，作为模拟土壤样品；

2.2前处理条件

2.2.1加速溶剂萃取法

准确称取10g制备好的土壤样品、加入萃取池体积70-90％的硅藻土，混匀后装入34ml的萃取池中，所用溶剂为二氯甲烷和正己烷(2：1，v/v)的混合溶剂，温度100℃，压强10.3mpa，预热5min，静态提取5min，循环2次，用萃取池体积60％的溶剂快速冲洗萃取池，氮气吹扫60s后，收集全部提取液，待做净化分析。

2.2.2样品净化与浓缩

在所得提取液中加入提取液体积2倍的纯水100ml，用氢氧化钠溶液调节至ph>12，充分振荡，静置分层后弃去下层有机相，保留水相部分。如被弃去的有机相颜色较深，可向水相中再加入二氯甲烷/正己烷混合溶剂(1:1，v/v)反萃取2～3次(加入量为水相体积的1/2)，弃去有机相；水相部分用盐酸溶液调节至ph<2，加入水相体积1/2的二氯甲烷/乙酸乙酯混合溶剂(4：1，v/v)25ml，振荡萃取2次，合并有机相，在自动浓缩仪上浓缩并转换溶剂(将溶液浓缩至近干，再加少量甲醇重复多次，最终转换成甲醇溶液)，用甲醇定容至1ml后进样分析。

2.3色谱-质谱分析条件

色谱条件：色谱柱：thermoacquityuplcbehc18柱(50mm×2.1mm，1.7μm)；流动相a：甲醇；流动相b：ph＝4.0的0.01mol/l甲酸铵-甲酸水溶液；梯度洗脱：0～0.2min，20％a；0.2～3min，20％a～60％a；3～5min，90％a；5～6min，20％a。流速0.4ml/min；柱温30℃；进样量5μl。

质谱采用电喷雾负离子电离(esi^-)模式、多反应监测模式(mrm)进行检测。质谱离子化参数：喷雾电压3200v，鞘气流量800l/h，辅助气流量6l/min，毛细管温度350℃。其他质谱条件见表1。

表15种硝基酚类污染物的保留时间和质谱条件

二、对比试验

1、提取溶剂的优化

硝基酚类物质极性较大，土壤基质复杂，提取过程在保证提取效率的同时，也会带来土壤中的大量极性干扰物质的基体影响，选取提取溶剂时同时尽量减少干扰物质的影响，降低对后续净化步骤影响，保证净化效果。实验中选取了二氯甲烷、正己烷、丙酮、乙酸乙酯这几种常用溶剂，对比不同溶剂配比后的提取效率、净化效果。结果表明二氯甲烷与正己烷(v/v＝2:1)体系和二氯甲烷与乙酸乙酯(v/v＝2:1)体系对硝基酚类的提取均有较好的效果，提取效率都在60％以上，但二氯甲烷与丙酮(v/v＝1:1)和正己烷与丙酮(v/v＝1:1)提取效率偏低，可能溶剂极性低，导致对硝基酚的提取性能不佳。对提取后的提取液检测结果显示，二氯甲烷与乙酸乙酯体系的杂质含量明显高于二氯甲烷与正己烷体系，提取液颜色更深，谱图的杂峰更多。最终选择二氯甲烷与正己烷(v/v＝2:1)混合溶剂提取。

2、液相流动相条件的优化

在液质法检测时，由于目标物需在溶液状态下通过电喷雾电离，流动相的组成和配比对于目标物质的离子化效率，检测灵敏度影响很大，对化合物的色谱行为也会有显著影响。本实验对比了甲醇-水，乙腈-水，甲醇-甲酸铵-甲酸水溶液体系，乙腈-甲醇-甲酸铵-甲酸水溶液体系等不同流动相组成对硝基酚类化合物保留行为的影响。

结果表明，在甲醇-水，乙腈-水体系下5种硝基酚保留效果较差，特别是2,4-二硝基酚，2-甲基，4,6-二硝基酚产生裂峰，峰形展宽。硝基酚类化合物的极性大，水溶性较强，其酚羟基使其具有一定的弱酸性，当流动相中加入甲酸-甲酸铵缓冲盐后，当流动相体系ph值降低，硝基酚类化合物的电离受到抑制，其主要以分子形式存在，与固定相的作用更强，保留效果也更好，峰形有明显改善，其中地乐酚和消螨酚的保留时间明显推后，峰形也更尖锐，见图1。但随着甲酸浓度提高，目标物响应值反而降低，有可能缓冲盐浓度太高反而抑制化合物的电喷雾的雾化效果和电离作用，结果显示0.01mol/l甲酸-甲酸铵溶液(约ph＝4.0)时硝基酚化合物具有最佳的响应。而有机相甲醇和乙腈对于目标物的峰形，灵敏度测定影响不大，甲醇-甲酸铵-甲酸水溶液体系的保留效果稍好，故本专利选择该体系作为流动相。

3、线性、精密度和检出限

将硝基酚混合标准溶液用甲醇水溶液(v:v＝1:1)逐级稀释，配制成系列浓度为10、50、100、250、500μg/l的标准工作溶液进行检测。以质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)分别绘制了5种硝基酚类化合物的标准曲线，结果表明，这5种硝基酚类在20-500μg/l的质量浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.9978-0.9998。根据《环境监测分析方法标准制修订技术导则》(hj168-2010)中的检出限试验方法确定5种硝基酚类化合物的检出限为0.002-0.008mg/kg(n＝7)。

表25种硝基酚的线性范围、线性回归方程、相关系数及检出限

表35种硝基酚在空白土壤基质加标测试中的精密度及回收率

分别对低、中、高3个浓度水平的阴性土壤样品进行平行加标测定(n＝6)，由表3可知，相对标准偏差(rsd)在0.8％-5.7％范围内，平均回收率为63％-90％，本专利建立的基于超高压高效液相色谱串联质谱法测定土壤中的5种硝基酚类化合物的方法，准确性好。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。