全氟辛酸和莠去津联合毒性的检测方法与流程

本发明涉及毒理学检测技术领域，具体而言，涉及一种全氟辛酸和莠去津联合毒性的检测方法。

背景技术：

全氟烷基物质(pfas)是一种高度氟化的脂肪族物质，广泛用于纺织、造纸、农药、灭火泡沫以及其他工业和民用领域。其中，全氟辛酸(pfoa)是环境中最典型的全氟化合物，也是环境中各种pfas的最终产品。pfoa难以降解，具有环境持久性和生物富集特性，并已在2009年列入持久性有机污染物(pops)清单。由于其迁移特性，沉积在陆地环境中的pfoa最终将流入地表水中，进而通过食物链的传播进入人体，对人类健康构成严重威胁。

三嗪类除草剂是一类高效除草杀虫剂，可抑制植物的光合作用，破坏细菌细胞膜功能，自1950年代以来已在世界范围内广泛使用。由于其使用量大，性质稳定且残留时间长，使用期间可能对土壤、农作物和水造成污染。目前市场上有13种三嗪类除草剂，其中莠去津以5亿美元以上的销售额位居榜首。2013年对中国莱州湾地表海水中的三嗪类除草剂的筛查发现莠去津的检出率为100％。

这些水体中的污染物威胁着水生生物甚至人类的健康，而环境中的污染物通常以复杂的混合物形式存在，与单一污染物相比，这可能会对生物体造成额外的影响。目前，还未有全氟辛酸和莠去津联合毒性的检测方法。

鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供全氟辛酸和莠去津联合毒性的检测方法。

本发明可这样实现：

本发明提供一种全氟辛酸和莠去津联合毒性的检测方法，主要包括以下步骤：

以不同浓度的二元混合物对斑马鱼胚胎进行暴露染毒试验以获得二元混合物引起斑马鱼组织器官病变的浓度效应关系，采用ci预测模型根据浓度效应关系计算出ci值以判断全氟辛酸和莠去津的联合作用方式。

其中，二元混合物为全氟辛酸与莠去津的混合物。

当ci值＜1时代表全氟辛酸和莠去津的联合作用方式为协同作用；当ci值＝1时代表全氟辛酸和莠去津的联合作用方式为相加作用；当ci值＞1时代表全氟辛酸和莠去津的联合作用方式为拮抗作用。

在可选的实施方式中，同一浓度的二元混合物中全氟辛酸与莠去津的毒性相等，不同浓度的二元混合物中全氟辛酸的毒性不同。

在可选的实施方式中，二元混合物由全氟辛酸的n倍ec50浓度或1/m的ec50浓度与莠去津的n倍ec50浓度或1/m的ec50浓度按等毒性的方式配置而成，其中，n和m均取值为1-10范围内的整数。

在可选的实施方式中，暴露染毒试验包括：于培养孔板的待测孔中加入3ml/孔的胚胎培养液、3μl/孔的全氟辛酸标准溶液或莠去津标准溶液以及10-30个/孔的斑马鱼胚胎，持续培养96-120h；培养过程中，每天观察及记录斑马鱼的死亡情况及斑马鱼胚胎的组织病变情况，移除死鱼；培养结束后，用麻醉剂麻醉仔鱼，观察统计斑马鱼的死亡情况及毒性终点。

在可选的实施方式中，胚胎培养液的ph为7-8，盐度为0.25-0.5％，电导率为500-800μs/cm。

在可选的实施方式中，麻醉剂为ms-222。

在可选的实施方式中，ms-222的浓度为1/100-1/150μmol/l。

在可选的实施方式中，以处于同一发育阶段的发育正常的斑马鱼胚胎进行暴露染毒试验。

在可选的实施方式中，组织器官病变指标包括肝脏病变、卵黄囊病变和脊柱病变中的至少一种。

在可选的实施方式中，肝脏病变包括肝脏缺失、肝脏变性及肝脏变小中的至少一种。

在可选的实施方式中，卵黄囊病变包括卵黄囊水肿和卵黄囊吸收延迟中的至少一种。

在可选的实施方式中，脊柱病变包括脊柱弯曲。

本申请的有益效果包括：

本申请以斑马鱼作为模式生物并以全氟辛酸和莠去津的二元混合物作为斑马鱼暴露检测的目标物，考虑到环境中多种污染物共存的情况开展联合暴露试验，为动物实验结果外推于人提供了合理的技术支撑。根据暴露染毒试验后斑马鱼组织器官的病变情况检测全氟辛酸和莠去津的联合毒性，能够得到较为准确的检测结果，有效降试验成本，提高操作的简便性，降低环境风险。本申请具有良好的剂-效关系，斑马鱼胚胎的各组织器官病变情况可以作为全氟辛酸和莠去津毒性检测的手段，为全氟辛酸和莠去津风险管理、生态安全和水生生态毒理学研究提供信息。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1和图2分别为实施例1中全氟辛酸和莠去津对斑马鱼胚胎暴露处理120h的logistics拟合曲线；

图3和图4分别为实施例2中全氟辛酸和莠去津暴露斑马鱼胚胎120h表型，其中s代表脊柱，l代表肝脏，y代表卵黄囊；

图5为实施例2中全氟辛酸对斑马鱼胚胎产生卵黄囊异常的浓度效应曲线(120h)；

图6至图8分别为实施例3中利用ca、ia和ci模型预测全氟辛酸和莠去津二元混合物引起斑马鱼胚胎卵黄囊异常、肝脏异常和脊柱弯曲的浓度效应曲线以及实际试验观察值；

图9至图11为实施例3中基于ci指数模型分析得出联合毒性强度及性质。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本申请提供的全氟辛酸和莠去津联合毒性的检测方法进行具体说明。

本申请提出一种全氟辛酸和莠去津联合毒性的检测方法，其主要包括以下步骤：以不同浓度的二元混合物对斑马鱼胚胎进行暴露染毒试验以获得二元混合物引起斑马鱼组织器官病变的浓度效应关系，采用ci预测模型根据浓度效应关系计算出ci值以判断全氟辛酸和莠去津的联合作用方式。

其中，二元混合物为全氟辛酸与莠去津的混合物。

可参照地，二元混合物经全氟辛酸和莠去津按等毒性比的方式配制而成。也即同一浓度的二元混合物中全氟辛酸与莠去津的毒性相等，不同浓度的二元混合物中全氟辛酸的毒性不同。具体的，二元混合物由全氟辛酸的n倍ec50浓度或1/m的ec50浓度与莠去津的n倍ec50浓度或1/m的ec50浓度按等毒性的方式配置而成，其中，n和m均取值为1-10范围内的整数。

多个不同浓度的二元混合物可经以下方式获得：将全氟辛酸和莠去津按照各自的ec50对应的浓度混合以得到第一个浓度，再以ec50为基础，按n倍ec50和1/mec50的浓度进行设置，其中，n和m均取值为1-10范围内的整数。

其中，ec50的确定可参照以下方式：

①、采用斑马鱼胚胎死亡率分别评估全氟辛酸和莠去津的急性毒性效应，确定全氟辛酸和莠去津分别对斑马鱼胚胎的120hlc50，以获得全氟辛酸和莠去津的毒性阈值。

具体的，可参照：

a、分别配制全氟辛酸和莠去津标准溶液，前者以水为溶剂，后者以二甲基亚砜为溶剂。

b、收集斑马鱼胚胎，将正常发育且发育时期一致的斑马鱼胚胎置于胚胎培养液中，控光培养。

其中，胚胎培养液符合ph为7-8，盐度为0.25-0.5％，电导率为500-800μs/cm。优选地，上述胚胎培养液的ph为7.5，盐度为0.25％，电导率为600μs/cm。

可参照地，胚胎培养液可含有以下成分：碳酸氢钠和氯化钠。其在使用时，可以是通过向超纯水中添加碳酸氢钠和氯化钠，使混合溶液符合上述ph、盐度及电导率。

在可选地实施方式中，培养过程可以26-30℃条件系进行，培养过程中的光照条件可以是光照强度为54-324lux。

c、进行斑马鱼胚胎暴露染毒试验。将b步骤中收集到的斑马鱼胚胎置于测试孔板(如6孔板或12孔板等)中，并加入胚胎培养液。实验设置正常对照组(control)(胚胎培养水处理组)、溶剂对照组(加有dmso)、全氟辛酸暴露组和莠去津暴露组，于恒温培养箱中培养。在实验过程中，每隔一定时间(例如24h)观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死鱼，异常情况拍照并记录；暴露一定时间(如120h)后，用麻醉剂将仔鱼麻醉，观察并统计斑马鱼的死亡情况，拍照记录。

可参考地，全氟辛酸暴露组和莠去津暴露组均可以是于待测孔中加入3ml/孔的胚胎培养液、3μl/孔的供试品标准溶液(全氟辛酸标准溶液或莠去津标准溶液)以及10-30个/孔的斑马鱼胚胎，持续培养96-120h。

其中，麻醉剂可以为ms-222，其浓度可以为1/100-1/150μmol/l，如1/100μmol/l、1/120μmol/l或1/150μmol/l等。

d、通过数学软件(如origin2018软件)对药物浓度和死亡率进行logistic曲线拟合，分别获得全氟辛酸和莠去津对斑马鱼胚胎的120hlc50。

②采用斑马鱼胚胎的组织病变指标评估全氟辛酸和莠去津的单一作用时对胚胎发育的影响。

具体的，可参照：

以全氟辛酸对斑马鱼胚胎1/16lc50、1/8lc50、1/4lc50、1/2lc50及lc50浓度对斑马鱼胚胎进行暴露染毒试验。

以莠去津对斑马鱼胚胎1/16lc50、1/8lc50、1/4lc50、1/2lc50及lc50浓度对斑马鱼胚胎进行暴露染毒试验。

暴露染毒试验的操作步骤和方法同上。

在实验过程中，每24h观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死鱼，异常情况拍照并记录；暴露120h后，用麻醉剂将仔鱼麻醉，观察并统计斑马鱼各个组织器官的病变情况，拍照记录。

其中，组织器官病变指标包括肝脏病变、卵黄囊病变和脊柱病变中的至少一种。

在可选的实施方式中，肝脏病变包括肝脏缺失、肝脏变性及肝脏变小中的至少一种。卵黄囊病变包括卵黄囊水肿和卵黄囊吸收延迟中的至少一种。脊柱病变包括脊柱弯曲。

在可选的实施方式中，拍照可采用具有照相功能的显微设备(例照相显微镜)进行。

通过数学软件(如origin2018软件)对药物浓度和组织器官病变指标发生率进行logistic曲线拟合，获得药物引起斑马鱼胚胎120h指标异常的浓度效应曲线，计算出药物对斑马鱼胚胎暴露处理的120h后，对各毒性指标的半数效应浓度(ec50)。

进一步地，采用斑马鱼胚胎的组织器官病变指标评估全氟辛酸和莠去津的联合作用时对胚胎发育的影响。

具体地，可参照：

以二元混合物按1/8ec50、1/4ec50、1/2ec50、ec50和2ec50(此处n取值为2，m取值为2、4和8)的多个浓度分别对斑马鱼胚胎进行暴露染毒试验。以1/8ec50浓度的二元混合物为例，其所谓的等毒性比配制即指以全氟辛酸的1/8ec50浓度和莠去津的1/8ec50浓度混合。也即可理解为：将单独的全氟辛酸或莠去津各自引起某一毒性的ec50先算出来，然后以全氟辛酸的ec50浓度和莠去津的ec50浓度去混合该两种药物，即得到二元混合物，该混合方式即为等毒性比混合。值得说明的是，上述二元混合物的ec50、全氟辛酸的ec50和莠去津的ec50在操作时，二元混合物的浓度并非仅限于上述浓度，可根据实际需要进行调整。优选地，二元混合物的多个不同浓度中至少具有ec50这一中间浓度。

暴露染毒试验的操作步骤和方法同上。

在实验过程中，每24h观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死鱼，异常情况拍照并记录；暴露120h后，用麻醉剂将仔鱼麻醉，观察并统计斑马鱼各个组织器官的病变情况，拍照记录。

本申请中，采用ci模型作为预测模型，根据ci模型评估二元混合物浓度、效应水平和ci指数(也即下称的ci值)之间的关系。

当ci值＜1时代表全氟辛酸和莠去津的联合作用方式为协同作用；当ci值＝1时代表全氟辛酸和莠去津的联合作用方式为相加作用；当ci值＞1时代表全氟辛酸和莠去津的联合作用方式为拮抗作用。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

采用斑马鱼胚胎死亡率分别评估全氟辛酸和莠去津的急性毒性效应。

a、配制全氟辛酸和莠去津标准溶液。

配制浓度为2000mg/l的全氟辛酸标准溶液，溶剂为纯水；配制浓度为1000mg/l、5000mg/l、10000mg/l、15000mg/l的莠去津标准溶液，溶剂二甲基亚砜。

b、收集斑马鱼胚胎。控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼14小时，夜10小时，采卵前一天21：00将性成熟的斑马鱼，按雌雄比为1：1的比例移至产卵缸内并隔开，次日上午9:00自然交配并收集受精卵，用胚胎培养液清洗两次收集得到的受精卵去除杂质，当2.5hpf时，在显微镜下挑选正常发育且发育时期一致的斑马鱼胚胎，置于胚胎培养液中，28℃进行控光培养。

其中，胚胎培养液符合：ph：7.5，盐度：0.25％，电导率：600μs/cm。胚胎培养液由超纯水中添加碳酸氢钠和氯化钠调节成上述ph、盐度和电导率。

培养过程中的光照条件为光照强度为200lux。

c：进行斑马鱼胚胎暴露染毒试验。将b步骤中收集得到的斑马鱼胚胎，置于6孔板中，每孔30个，加入3ml胚胎培养水。实验设置正常对照组(control)(胚胎培养水处理组)、溶剂对照组(加入3μl0.1％dmso)、全氟辛酸暴露组(分别加入7.5μl、15μl、75μl、150μl、300μl、600μl、900μl浓度为2000mg/l的全氟辛酸标准溶液，并用胚胎培养水定容至3ml，最终暴露浓度为5mg/l、10mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、400mg/l、600mg/l)和莠去津暴露组(分别加入3μl不同浓度的莠去津标准溶液，最终暴露浓度为0.5mg/l、1mg/l、5mg/l、10mg/l、15mg/l)，每个处理设置三个平行，于28℃恒温培养箱中培养。在实验过程中，每24h观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死鱼，异常情况拍照并记录；暴露120h后，用麻醉剂将仔鱼麻醉，观察并统计斑马鱼的死亡情况，拍照记录。

麻醉剂为：1/150μmol/l的ms-222。

通过对实施例1的结果分析，发现在本实施例中，全氟辛酸和莠去津对斑马鱼胚胎死亡率的影响如下：

通过origin2018软件对浓度和死亡率进行logistic曲线拟合，得到曲线如图1和图2所示。通过图1和图2计算出全氟辛酸和莠去津对斑马鱼胚胎的120hlc50分别为224.6081mg/l和11.90376mg/l。

实施例2

采用斑马鱼胚胎的肝脏毒性指标、卵黄囊毒性指标和脊柱毒性指标评估全氟辛酸和莠去津的单一作用时对胚胎发育的影响。

分别以全氟辛酸和莠去津对斑马鱼胚胎1/16lc50、1/8lc50、1/4lc50、1/2lc50和lc50浓度对斑马鱼胚胎进行暴露染毒试验。

暴露染毒试验的操作步骤和方法同实施例1。

在实验过程中，每24h观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死鱼，异常情况拍照并记录；暴露120h后，用麻醉剂将仔鱼麻醉，观察并统计斑马鱼各个组织器官的病变情况，拍照记录。

通过对实施例2的结果分析，发现在本实施例中，全氟辛酸和莠去津对斑马鱼胚胎肝脏、卵黄囊、脊柱发育的影响如图3和图4所示。

对肝脏异常、卵黄囊异常和脊柱弯曲三个指标进行统计，通过origin2018软件对浓度和异常率进行logistic曲线拟合(其中，全氟辛酸引起斑马鱼胚胎120h卵黄囊异常的浓度效应曲线如图5所示)，计算出全氟辛酸和莠去津对斑马鱼胚胎暴露处理的120h后，对肝脏异常、卵黄囊异常以及脊柱弯曲等指标的半数效应浓度(ec50)分别如表1所示。

表1全氟辛酸和莠去津对斑马鱼胚胎各毒性指标的ec50值

由ec50值可以得出，在这三个指标中，全氟辛酸主要引起斑马鱼胚胎的卵黄囊异常，其次引起肝脏异常和脊柱弯曲的程度相似；莠去津也主要引起斑马鱼胚胎的卵黄囊异常，其次是肝脏异常，再者是脊柱弯曲。

实施例3

采用斑马鱼胚胎的肝脏毒性指标、卵黄囊毒性指标、脊柱毒性指标评估全氟辛酸和莠去津的联合作用时对胚胎发育的影响。

分别以全氟辛酸和莠去津对斑马鱼胚胎产生肝脏异常、卵黄囊异常、和脊柱弯曲的1/8ec50、1/4ec50、1/2ec50、ec50和2ec50系列浓度对斑马鱼胚胎进行暴露染毒试验。

暴露染毒试验的操作步骤和方法同实施例1。

在实验过程中，每24h观察记录斑马鱼的死亡情况并移除死鱼，异常情况拍照并记录；暴露120h后，用麻醉剂将仔鱼麻醉，观察并统计斑马鱼各个组织器官的病变情况，拍照记录。

为了预测二元混合物对斑马鱼胚胎的毒性较单一药物的作用方式，分别采用ca、ia和ci模型对全氟辛酸和莠去津二元联合效应进行预测和拟合优度估计。

图6至图8分别为利用ca、ia和ci模型预测全氟辛酸和莠去津二元混合物引起斑马鱼胚胎卵黄囊异常、肝脏异常和脊柱弯曲的浓度效应曲线，以及实际试验观察值(exp)。其中，ca模型指浓度加和模型，ia模型指独立作用模型，ci模型指联合指数模型。浓度加和模型和独立作用模型用于化学混合物毒性的加和性检验：若混合物毒性(实验测得值)与由选定的模型预测的毒性一致,则认为混合物毒性具有加和性,此时混合物体系的毒性可由该参考模型预测。若混合物毒性偏离预测毒性,则认为该混合物具有毒性相互作用即协同(大于预测毒性)或拮抗(小于预测毒性)，其毒性是非加和的,不能由加和模型预测。

由图6至图8可以看出，不同模型针对混合物预测评估能力具有很大差异，ci模型剂量效应关系与实际试验观察值较为吻合，预测能力优于ca和ia模型，因此选用ci模型对全氟辛酸和莠去津的联合作用方式进行预测。在所设定的浓度范围内，ci值均小于1，表明全氟辛酸和莠去津二元混合物的引起斑马鱼胚胎卵黄囊异常、肝脏异常和脊柱弯曲的联合作用方式均为协同作用。根据ci模型评估联合组浓度、效应水平和ci指数之间的关系，发现总体趋势随着混合物浓度的升高，毒性效应不断增强。针对卵黄囊异常、肝脏异常及脊柱弯曲3个毒性指标：在实验浓度范围内，呈现增毒及协同效应，且随效应的增强，由轻微增毒逐步过渡至协同效应。

再结合图9至图11，多种毒性指标及ci模型评估验证了全氟辛酸和莠去津的联合毒性作用在高剂量水平下多表现为协同效应，对风险具有放大作用。

综上，本申请以斑马鱼作为模式生物并以供试品标准溶液作为斑马鱼暴露检测的目标物，考虑到环境中多种污染物共存的情况开展联合暴露试验，为动物实验结果外推于人提供了合理的技术支撑。根据暴露染毒试验后斑马鱼胚胎的死亡和肝脏病变、卵黄囊病变和脊柱病变情况检测全氟辛酸和莠去津的联合毒性，能够得到较为准确的检测结果，有效降试验成本，提高操作的简便性，降低环境风险。本申请具有良好的剂-效关系，斑马鱼胚胎的各组织病变情况可以作为全氟辛酸和莠去津毒性检测的手段，为全氟辛酸和莠去津风险管理、生态安全和水生生态毒理学研究提供信息。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。