用于检测和/或治疗三阴性乳腺癌的DNA核酸链靶向系统及其制备和应用

用于检测和/或治疗三阴性乳腺癌的dna核酸链靶向系统及其制备和应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，提供了一种用于检测和/或治疗三阴性乳腺癌的dna核酸链靶向系统及其制备和应用。


背景技术：

2.三阴性乳腺癌(tnbc)是最具侵袭性以及转移性的乳腺癌亚型，总发病率为15-20％，其雌激素受体、黄体酮受体以及人表皮生长因子受体2(her2)的表达呈阴性，超声和乳房x线检查或者肿瘤解剖成像是tnbc的传统诊断方法，但这些方法是基于癌症晚期表现的影像学特征，可能会导致假阴性结果。由于与癌症相关的细胞分子异常变化比肿瘤大小的变化可以更早地被检测，因此可以使用靶向配体或信号成分的分子探针来更早地检测tnbc。并且目前临床tnbc的治疗手段为手术切除、化疗、放疗，一旦癌症发生远端转移，对化疗的敏感性就会大大降低，并且用于激素和her-2受体阳性癌症的靶向疗法无法针对tnbc的治疗，因此，能高效抑制癌细胞的转移对tnbc的治疗以及阻止复发至关重要。
3.tnbc细胞表面部分靶标受体过表达，如cd44受体或者核仁素(ncl)，可以作为诊断tnbc的分子探针的靶标。当受体与配体结合时，可以增强癌细胞的侵袭性，抑制受体的激活可以抑制肿瘤的转移，也可以达到一个降低下游信号通路激活的作用。适体又称为化学抗体，可以通过指数富集技术(selex)对指定受体蛋白进行多轮筛选出具有高度结构化的dna或者rna寡核苷酸链，具有高亲和力、特异性的靶标结合能力以及可以量产等优点，适配体可用作配体激动剂、抑制剂、纳米治疗载体或者成像剂等，针对癌细胞膜表面过表达的受体蛋白cd44与ncl，已开发出其特异性结合的适体如：cd44硫代适体(ta)以及as1411，在tnbc的治疗中得到一定的研究。
4.临床证实三阴性乳腺癌细胞膜表面受体蛋白cd44与核仁素(ncl)的表达水平升高，当cd44与透明质酸特异性结合时，可异常激活与肿瘤转移高度相关的pi3k/akt、mapk/erk1/2等信号通路。ncl作为癌细胞膜上的锚蛋白，调节一组与癌症转移相关的microrna的成熟，在上皮-间质转化(emt)过程中发挥重要作用。这些受体的功能表达与tnbc侵袭性高、预后差呈正相关，因此干扰cd44与ncl受体蛋白激活从而减少胞内信号通路表达的治疗手段，有望成为抑制tnbc转移的一种高效策略。本发明利用适体人工诱导cd44与ncl受体蛋白聚集，实现双重特异性生物标志物(cd44与ncl)的鉴定与表征，同时阻断受体蛋白与配体因子的结合，抑制三阴性乳腺癌的转移。


技术实现要素：

5.针对上述背景技术中的问题，本发明的首要目的是提供一种用于检测和/或治疗三阴性乳腺癌的dna核酸链靶向系统，利用cd44受体蛋白与核仁素蛋白的特异性适体以及一段核酸linker链将两种细胞膜受体聚集，达到同时检测检测三阴性乳腺癌，以及抑制癌症转移的效果。
6.用于检测和/或治疗三阴性乳腺癌的dna核酸链靶向系统，包括靶向cd44受体的适体s1链、靶向核仁素受体的适体s2链、与s2链结合的s3链和s4链；
7.四条链的设计满足：
8.(1)s1链连接碱基序列linker1，s2链连接碱基序列linker 2，linker1与linker2序列能够碱基互补配对，且均有荧光标记，结合后发生fret效应，
9.(2)s3链与s2链的适体序列和linker2序列部分结合；
10.(3)s4链与s2链的linker2序列互补结合，s4链用荧光淬灭基团标记；
11.(4)当s1链、s2链中适体序列部分与三阴性乳腺癌细胞表面cd44、核仁素受体蛋白结合后，linker1与linker2序列开始碱基互补配对，s3链和s4链均与s2链解旋，恢复s2链上的荧光信号，s2链与s1链发生荧光能量共振转移效应。具体原理示意图如图1。
12.s1链中cd44硫代适体碱基序列部分，用磷硫键取代腺嘌呤脱氧核苷酸3’端的磷氧键。
13.硫代适体通过在dna链修饰硫原子，可以增强dna链在血清中的稳定性，并且也可以增强dna适体对配体的结合能力，本发明中所用的cd44硫代适体可以特异性结合三阴性乳腺癌表面过表达的cd44受体。
14.s1链中cd44硫代适体碱基序列与linker1序列之间用2-5个腺嘌呤脱氧核苷酸碱基a连接；
15.s1链的a碱基与linker1序列中间采用cy3荧光标记；
16.s2链的3’端采用cy5荧光标记；
17.s4链的5’端用淬灭基团bhq2标记；与s2链的linker2序列互补结合，淬灭基团bhq2可以淬灭s2链的cy5的荧光。
18.s1链的碱基序列长度包括30个碱基的cd44适体序列、2-5个a碱基序列以及16-20个碱基的linker1序列。
19.s2链的碱基序列长度包括26个碱基的as1411适体序列以及16-20个碱基的linker2序列。
20.linker1序列碱基长度与linker2序列碱基长度相等。
21.s3链的碱基序列长度为10-12个碱基与s2链上的适体序列与linker2序列部分互补。
22.用含有10-12个碱基的s3链与s2链进行互补杂交，互补杂交范围是s2链上as1411序列的第21个碱基至s2上linker2序列的第4-6个碱基；
23.用含有10-12个碱基的s4链与s2链进行互补杂交，互补杂交范围是s2链上linker2序列的第7-9个碱基至s2上linker2序列的第16-20个碱基。
24.s3序列的碱基长度与s4序列碱基长度相等，其长度随linker2序列长度不同而变化。
25.s1链序列为：
[0026]5’‑
cca*a*ggcctgca*a*ggga*a*cca*a*gga*ca*ca*gaa-cy3-gactagcgatgagtaacg-3’，*为磷硫键；
[0027]
s2链序列(as1411序列为第1个碱基至第26个碱基)(linker2序列为第27个碱基至第44个碱基)为：
[0028]5’‑
ggtggtggtggttgtggtggtggtggcgttactcatcgctagtc-cy5-3’；
[0029]
核仁素as1411适体是一条含有规则碱基排列顺序的富含鸟嘧啶(g)寡核苷酸链，以稳定的g-四链体结构结合癌细胞膜表面过表达核仁素受体，且不易被血清酶降解。
[0030]
s3链序列为：
[0031]5’‑
taacgccacca-3’[0032]
s4链序列为：
[0033]5’‑
bhq2-gactagcgatg-3’。
[0034]
本发明的第二个目的是提供所述的用于检测和/或治疗三阴性乳腺癌的dna核酸链靶向系统的制备方法，包括以下步骤：
[0035]
在pbs缓冲溶液中依次加入s2链、s3链和s4链，混匀后，置于pcr热循环仪中加热至95℃，在95℃条件下合成5min后，置于冰上快速冷却10分钟至0℃，藏于4℃冰箱静置过夜，与单独备用的s1链构成。
[0036]
本发明的第三个目的是提供所述的用于检测和/或治疗三阴性乳腺癌的dna核酸链靶向系统在制备辅助诊断和/或治疗三阴性乳腺癌制剂中的应用。
[0037]
进一步地，所述的治疗三阴性乳腺癌制剂是指抑制癌细胞转移的制剂。
[0038]
本发明有益效果
[0039]
1.本发明设计了用于同时检测三阴性乳腺癌细胞膜上两种受体蛋白的双核酸适体链，当适体序列与cd44受体和核仁素受体结合后，linker序列部分进行碱基互补结合，发生fret效应，可以区分三阴性乳腺癌细胞(mda-mb-231)、乳腺癌细胞(mcf-7)与正常细胞(l02)。
[0040]
2.本发明提供的双核酸适体链可以聚集三阴性乳腺癌细胞两类受体蛋白，抑制其与配体结合，从而干扰其与转移的相关信号通路激活，最终抑制三阴性乳腺癌的转移。
附图说明
[0041]
图1是本发明dna核酸链靶向系统的cd44受体与核仁素受体响应原理示意图。
[0042]
图2是dna链的聚丙烯凝胶电泳成像图。
[0043]
图3是dna链的荧光信号响应图。
[0044]
图4是硫修饰与没有硫修饰的dna链的聚丙烯凝胶电泳成像图(a)和灰度分析图(b)。
[0045]
图5是mda-mb-231(a)、mcf-7(b)和l02细胞(c)对dna链的流式细胞荧光计数图。
[0046]
图6是mda-mb-231、mcf-7和l02细胞对dna链的高内涵细胞成像图。
[0047]
图7是dna链处理mda-mb-231细胞后的细胞划痕图(a)与细胞迁移率图(b)。
[0048]
图8是dna链处理mda-mb-231细胞后的细胞迁移(a)与侵袭(b)图。
具体实施方式
[0049]
为了更好地阐述本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的说明。
[0050]
实施例1：dna双适体核酸链的凝胶电泳表征
[0051]
先合成以下dna链：
[0052]
s1链序列为：
[0053]5’‑
cca*a*ggcctgca*a*ggga*a*cca*a*gga*ca*ca*gaa-cy3-gactagcgatgagtaacg-3’，*为磷硫键；
[0054]
s2链序列(含适体as1411)为：
[0055]5’‑
ggtggtggtggttgtggtggtggtggcgttactcatcgctagtc-cy5-3’；
[0056]
s3链序列为：
[0057]5’‑
taacgccacca-3’[0058]
s4链序列为：
[0059]5’‑
bhq2-gactagcgatg-3’。
[0060]
为了验证所设计的dna链是否能成功结合(本发明原理示意图1)，各取2μl浓度为5μm的dna链s1(a)、s2(b)、s1-s2(c)、s2-s4(d)、s2-s3(e)、s2-s3-s4(f)(c、d、e、f管中每一种dna链都加入相同浓度和体积用于合成)加入pbs缓冲溶液定量至10μl，吹打均匀，置于pcr热循环仪中加热至95℃，在95℃条件下保持5min后，置于冰上快速冷却10分钟，得到dna合成链。另取dna合成链s2-s3-s4(f)、s2-s3(e)、s2-s4(d)中加入2μl浓度为5μm的dna链s1，在水平摇床上摇晃2h，得到dna合成链g-i。对所制备的样品a-i进行聚丙烯凝胶电泳表征。
[0061]
如图2所示，凝胶电泳条带的高低代表dna分子量的大小，电泳条带越高表示dna的分子量越大，dna合成链s1-s2(c)、s2-s4(d)、s2-s3(e)、s2-s3-s4(f)的凝胶电泳条带高于s1(a)、s2(b)单链条带，dna合成链(c-f)分子量高于dna单链，且s1-s2(c)由于碱基数量最多，其凝胶电泳条带最高，证明所设计的双适体核酸链可以通过上述方法合成结合。dna合成链s2-s3-s4(f)、s2-s3(e)与dna链s1结合实验中，由于在体外环境，dna链s2中适体链部分未与核仁素受体结合，故dna链s3没有离开s2链，dna链s1无法与链s2结合，其凝胶电泳条带(g)、(h)的高度与dna合成链s2-s3-s4(f)、s2-s3(e)一致。而在s2-s4(d)中，dna链s2与链s1的结合部分未被链s3结合，可以进行双适体链的合成，其凝胶电泳条带(i)的高度与dna合成链s1-s2(c)一致，即证明所设计的dna短链s3可以干扰dna链s1与s2在体外环境的结合。
[0062]
实施例2：dna双适体核酸链的体外荧光表征
[0063]
分别取10μl浓度为1μm的dna链s1、s1-s2、s2-s3-s4、s2-s4(管中每一种dna链都加入相同浓度和体积用于合成)加入pbs稀释到90μl，吹打均匀，置于pcr热循环仪中加热至95℃，在95℃条件下保持5min后，置于冰上快速冷却10分钟，得到dna结合链，随后在s2-s3-s4与s2-s4的dna合成链中加入10μl dna链s1在水平摇床上摇晃2h。采用荧光分光光度计对上述合成的dna链验证荧光能量共振转移(fret)效应。
[0064]
如图3所示，dna链s1-s2合成链在发射波长562nm处的cy3荧光强度显著低于dna链s1上的cy3荧光强度，在发射波长665nm处有一个荧光增强信号，表示dna链s1-s2可以发生fret效应。在dna链s2-s3-s4与链s1的摇晃实验中，在体外环境下，dna链s2中适体链部分未与核仁素受体结合，故dna链s3没有离开s2链，dna链s1无法与链s2结合，其荧光信号与dna链s1一致。在dna链s2-s4与链s1的摇床结合中，dna链s2与链s1的结合部分未被链s3结合，dna链s1可以与链s2进行合成，含有淬灭基团的dna链s4离开s2链，恢复dna链s2的cy5荧光，可以发生fret效应。
[0065]
实施例3：dna双适体核酸链的血清稳定性。
[0066]
dna链s1的磷硫键与dna链s2中的双链体结构可以提高核酸链在血清中的稳定性，
未用磷硫键修饰的dna链s1’(modified without ps)以及用磷硫键修饰的dna链s1(modified with ps)通过linker序列与dna链s2结合后，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测稳定性差异。
[0067]
各取10μl浓度为10μm的dna链s1(含硫)或者dna链s1’(无硫)与dna链s2(含pbs缓冲溶液)，吹打均匀，置于pcr热循环仪中加热至95℃，在95℃条件下保持5min后，置于冰上快速冷却10分钟，得到双适体结合链。用含10％胎牛血清(fbs)的1640培养基稀释上述双适体结合链(样品浓度均为1μm)，在细胞培养箱中分别放置0h、6h、12h、24h、36h、48h(37℃，5％co2)。在浓度为15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳中进行dna条带表征。如图4所示，含有磷硫键修饰的dna链稳定性更强。
[0068]
实施例4：dna双适体链的流式实验
[0069]
以三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231作为阳性细胞，以mcf-7、l02细胞作为阴性细胞。将mda-mb-231/mcf-7/l02细胞以1
×
104个/孔的密度接种到24孔板里，在细胞孵育箱中(37℃，5％co2，饱和湿度下)用完全培养基(1640/dmem+10％血清+1％双抗)培养24小时，析出培养液，随后使用1640培基(dmem培基)稀释dna链s1加入孔1中，1640培基(dmem培基)稀释dna链s2加入孔2中，1640培基(dmem培基)稀释已经合成好的s2-s3-s4dna链加入孔3中，体积均为1ml，浓度均为200nm，孵育2h。另取相同浓度与体积的dna链s1加入孔4，与细胞孵育15分钟后，吸出s1培养液，再加入相同浓度与体积的dna合成链s2-s3-s4与细胞孵育2h。用37℃的pbs分别洗涤每孔细胞两次，加入200μl的胰酶消化液，在细胞孵育箱中消化1min，每孔加入500μl的细胞培养液(含血清)，收集细胞，通过流式细胞仪进行细胞荧光计数。
[0070]
如图5所示，mda-mb-231细胞上cd44受体与核仁素受体表达呈阳性，dna链s1和链s2均可与mda-mb-231细胞结合(图5a)，当细胞与dna链s2-s3-s4孵育时，由于dna链s4上的bhq2基团淬灭链s2上的cy5荧光，故其细胞荧光计数显著降低，而当加入dna链s1后，dna链s1与dna链s2在细胞上进行合成，含有淬灭基团的dna链s4离开s2链，恢复dna链s2上的cy5荧光，并且cy3与cy5发生fret效应，dna链s1上cy3荧光有一定的降低。mcf-7细胞上cd44受体表达呈阴性，核仁素受体表达呈阳性，故dna链s2上核仁素适体链部分可以与mcf-7细胞结合(图5b)，而dna链s1上的cd44适体链部分不能与mcf-7细胞结合，无法发生fret效应。l02细胞上cd44受体与核仁素受体表达均呈阴性，dna链s1与链s2均无法与l02细胞结合(图5c)，无法发生fret效应。上述表明，设计合成的dna链s1与dna链s2-s3-s4可以鉴别mda-mb-231细胞。
[0071]
实施例5：dna双适体链的高内涵细胞成像实验
[0072]
以三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231作为阳性细胞，以mcf-7、l02细胞作为阴性细胞。将mda-mb 231/mcf-7/l02细胞以6
×
103个/孔的密度接种到96孔板里，在细胞孵育箱中(37℃，5％co2，饱和湿度下)用完全培养基(1640/dmem+10％fbs+1％双抗)培养24小时，析出培养液，随后使用1640培基(dmem培基)稀释的dna链s1与细胞孵育15分钟后，浓度为200nm，体积为100μl，吸出s1链培养液，再加入相同浓度与体积的合成好的s2-s3-s4dna链与细胞孵育2h。最后用37℃的pbs洗涤细胞两次，每孔加入100μl pbs缓冲溶液，通过高内涵成像仪进行细胞荧光成像。
[0073]
如图6所示，mda-mb-231细胞上cd44受体与核仁素受体表达呈阳性，dna链s1和链s2均可与mda-mb-231细胞结合，当加入dna链s1后，dna链s1与dna链s2在细胞上进行合成，
含有淬灭基团的dna链s4离开s2链，恢复dna链s2上的cy5荧光，并且cy3与cy5发生fret效应。mcf-7细胞上cd44受体表达呈阴性，核仁素受体表达呈阳性，故dna链s2上核仁素适体链部分可以与mcf-7细胞结合，而dna链s1上的cd44适体链部分不能与mcf-7细胞结合，s2链上的cy5荧光无法恢复，不能发生fret效应。l02细胞上cd44受体与核仁素受体表达均呈阴性，dna链s1与链s2均无法与l02细胞，无法发生fret效应。上述表明，设计合成的dna链s1与dna链s2-s3-s4可以鉴别mda-mb-231细胞。
[0074]
实施例6：dna双适体链的细胞划痕实验
[0075]
将mda-mb-231细胞以2
×
105个/孔的密度接种到6孔板里，在细胞孵育箱中(37℃，5％co2，饱和湿度下)用完全培养基(1640+10％fbs+1％双抗)培养，待细胞铺满6孔板的85％时，用100μl枪头垂直于细胞6孔板进行划线，析出培养液以及未贴壁细胞。在孔1中加入1ml1640培养基作为空白对照组，使用1640培基稀释dna链s1加入孔2中，1640培基稀释dna链s2加入孔3中，1640培基稀释dna合成链s1-s2加入孔4中，体积均为1ml，浓度均为200nm，细胞孵育。另取相同浓度与体积的dna链s1加入孔5，与细胞孵育15分钟后，吸出s1培养液，再加入相同浓度与体积的合成好的s2-s3-s4dna链与细胞孵育。在孵育时间为0h、24h时，通过倒置荧光显微镜进行细胞白场成像，采用imagej软件分析划痕宽度。
[0076]
如图7所示，dna链s1与dna合成链s1-s2的细胞划痕宽度(图7a)和细胞迁移率(图7b)高于空白组，dna链s2组的迁移率低于空白组，而加入dna链s1与dna链s2-s3-s4组(图7中s2’代表s2-s3-s4)的细胞迁移率显著低于空白组，表明本发明所设计的dna链可以将细胞上的cd44受体与核仁素受体结合，干扰受体的生理功能，从而降低三阴性乳腺癌细胞的转移能力。
[0077]
图7中右图中从左至右依次是空白、s1、s2、s1-s2、s1-s2’。
[0078]
实施例7：dna双适体链的迁移与侵袭实验
[0079]
细胞迁移实验使用的主要细胞培养板为transwell小室。细胞侵袭实验在迁移实验的基础上对transwell小室添加了基质胶，其制备过程如下，使用预冷的1640培基稀释基质胶，稀释比例为基质胶：1640培基＝1:8，吸取40μl稀释后的基质胶加入transwell上室中，均匀平铺在底部，放入培养箱中1h，使胶凝固，得到侵袭实验小室。
[0080]
将mda-mb-231细胞以5
×
105个/孔的密度接种到6孔板里，在细胞孵育箱中(37℃，5％co2，饱和湿度下)用完全培养基(1640+10％fbs+1％双抗)培养24小时，析出培养液，在孔1中加入1ml1640培基与细胞孵育，作为空白对照组，随后使用1640培基稀释的dna链s1加入孔2中，在孔3中加入1640培基稀释的dna链s2，浓度均为200nm，体积均为1ml，细胞孵育时间为2h。在孔4中相同浓度与体积的dna链s1与细胞孵育15分钟后，吸出s1链培养液，再加入相同浓度与体积的合成好的s2-s3-s4dna链与细胞孵育2h(图8中s2’代表s2-s3-s4)。孵育时间结束后，用37℃的pbs分别洗涤每孔细胞两次，加入200μl的胰酶消化液，在细胞孵育箱中消化1min，每孔加入500μl的细胞培养液(含血清)，离心收集细胞，去掉培养液后加入1640培养基，制成细胞悬液，将孔1-4中的细胞按照1
×
105个/孔的密度分别加入迁移实验小室的孔1-4中，每孔细胞悬液体积为200μl。将孔1-4中的细胞按照1
×
105个/孔的密度分别加入侵袭实验小室的孔1-4中，每孔细胞悬液体积为200μl。在每个tranwell的下室中添加含10％fbs的1640培基700μl。细胞孵育24小时，随后吸出上室细胞悬液，将各孔transwell小室放入pbs中洗涤两次，在transwell下室中加入600μl的4％多聚甲醛固定
tranwell小室底部的细胞，固定时间为15min，吸出多聚甲醛，在下室中加入600μl的结晶紫染色液，对下室的细胞进行染色，时间为15min，回收染色液，用pbs洗涤transwell小室两次，于倒置荧光显微镜下随机挑选5个视野拍照成像，使用imagej对视野中的细胞进行计数。
[0081]
如图8所示，transwell小室上室细胞悬液中不含血清，而下室包含血清，在血清的诱导下，细胞可以穿过transwell小室底部，空白对照组的细胞迁移与侵袭的数量最多，说明细胞保持了原有的转移能力，而使用dna链s1与s2处理后的细胞，其细胞迁移与侵袭的数量有少量减少，说明适体对细胞表面受体有一定的影响，可以减弱其迁移与侵袭的能力，但通过双适体链处理后的细胞，其细胞迁移与侵袭数量明显减少，说明双适体链可以通过聚集受体蛋白，从而抑制细胞迁移与侵袭的能力，有效减少三阴性乳腺癌的转移。
[0082]
以上实施例为本发明的优选实施方式，仅用于说明本发明的技术方案而非限制，应当理解在不脱离本发明原理的范围内还存在多种替换方案，这并不影响本发明的实质内容。