一种检测氟雷拉纳含量的方法与流程

1.本发明涉及药物分析领域，特别涉及一种检测氟雷拉纳含量的方法。


背景技术：

2.氟雷拉纳是一种新型的异噁唑啉化合物，其通过干扰寄生虫的γ-氨基丁酸(gaba)门控氯离子通道发挥作用导致神经系统过度兴奋而死亡。一剂局部用溶液可提供广谱和持久的保护，在2小时内开始杀死跳蚤，8小时内杀死100％的跳蚤，并控制4种蜱虫(黑腿蜱，美洲犬蜱，棕色犬蜱和孤星蜱)，消除了已有的跳蚤感染，控制着跳蚤产卵、幼虫发育和繁殖等，持续效果长达12周。氟雷拉纳上市的品种包括氟雷拉纳咀嚼片、氟雷拉纳局部外用溶液，氟雷拉纳莫昔克丁局部外用溶液。其中2016年7月20日美国fda批准氟雷拉纳局部外用溶液用于预防与治疗猫、狗的跳蚤、蜱虫等感染，该产品为进入中国，但氟雷拉纳咀嚼片于2019.04.23获得中国农业农村部颁发的兽药进口批件。
3.为了保证氟雷拉纳后续的研发和生产质量，需要对氟雷拉纳制剂的质量进行控制。虽然氟雷拉纳中间体有相关的专利文献报道，如中国专利“一种氟雷拉纳中间体及其杂质的检测方法”(公开号：cn114113390a)检测的氟雷拉纳中间体及其杂质的含量。但目前尚未有关于氟雷拉纳制剂中氟雷拉纳检测方法的专利文献报道，提供一种氟雷拉纳制剂氟雷拉纳含量的检测方法，有助于控制氟雷拉纳制剂质量。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种检测氟雷拉纳含量的方法。
5.本发明所采取的技术方案是：
6.一种检测氟雷拉纳含量的方法，包括如下步骤：
7.1)配制氟雷拉纳的标准品溶液；
8.2)配制供试品溶液；
9.3)使用反相高效液相色谱仪测定标准品溶液中的氟雷拉纳，使得色谱图中氟雷拉纳与其相邻峰之间的分离度≥1.5；
10.4)使用反相高效液相色谱仪测定供试品溶液；
11.5)依照标准品溶液的色谱图和供试品溶液的色谱图，利用外标法确定供试品溶液中氟雷拉纳的含量。
12.在一些方法的实例中，所述反相高效液相色谱仪的条件为：流动相为乙腈水溶液，所述乙腈水溶液体积浓度为40％～60％，进行梯度洗脱。
13.在一些方法的实例中，所述高效液相色谱中的流速为0.9～1.1ml/min。
14.在一些方法的实例中，所述高效液相色谱中的色谱柱温为25～40℃。
15.在一些方法的实例中，所述供试样品溶液中氟雷拉纳的浓度为0.3～1mg/ml。
16.在一些方法的实例中，所述标准品溶液中氟雷拉纳的浓度为0.3～1mg/ml。
17.在一些方法的实例中，所述反相高效液相色谱中的进样量为5～20ul。
18.在一些方法的实例中，所述标准品溶液和供试品溶液的溶剂为体积分数为60％～70％乙腈水溶液。
19.在一些方法的实例中，所述高效液相色谱的仪的色谱柱为waters xterra rp 8色谱柱：4.6
×
250mm，5μm。
20.在一些方法的实例中，所述反相高效液相色谱的紫外检测波长为245nm～255nm。
21.在一些方法的实例中，包括如下步骤：
22.1)使用体积分数为60％～70％乙腈水溶液配制氟雷拉纳的标准品溶液，所述标准品溶液中氟雷拉纳的浓度为0.3～1mg/ml；
23.2)使用体积分数为60％～70％乙腈水溶液配制供试品溶液，所述供试样品溶液中氟雷拉纳的浓度为0.3～1mg/ml；
24.3)使用反相高效液相色谱仪测定标准品溶液中的氟雷拉纳，使得色谱图中氟雷拉纳与其相邻峰之间的分离度≥1.5，
25.4)使用反相高效液相色谱仪测定供试品溶液；
26.5)依照标准品溶液的色谱图和供试品溶液的色谱图，利用外标法确定供试品溶液中氟雷拉纳的含量；
27.所述反相高效液相色谱仪的条件为：流动相为乙腈水溶液，所述乙腈水溶液体积浓度为40％～60％，进行梯度洗脱，进样量为5～20ul，色谱柱为waters xterra rp 8色谱柱：4.6
×
250mm，5μm。紫外检测波长为245nm～255nm。
28.本发明的有益效果是：
29.本发明能够准确测定氟雷拉纳制剂中氟雷拉纳的含量，检测无干扰方法可靠稳定，重复性好、准确度高、精密度高，该检测方法的氟雷拉纳的回收率大于98％。
附图说明
30.图1是本发明实施例1中空白辅料的反相高效液相色谱图。
31.图2是本发明实施例1中供试品溶液的反相高效液相色谱。
32.图3是本发明实施例2中标准品溶液的反相高效液相色谱。
33.图4是本发明实施例3中标准品溶液的线性图。
34.图5是本发明实施例中供试品溶液的反相高效液相色谱。
具体实施方式
35.实施例1：空白辅料对氟雷拉纳含量检测的干扰试验
36.包括如下步骤：
37.1)配制氟雷拉纳的空白辅料溶液
38.取空白辅料160mg，精密称定至100ml容量瓶中，用乙腈溶剂稀释1000ml，摇匀，作为空白辅料溶液。
39.2)配制供试品溶液
40.取氟雷拉纳制剂适量(含氟雷拉纳100mg)，用乙腈溶剂稀释制成每1ml含氟雷拉纳500μg供试品溶液。
41.3)反相高效液相色谱测定
42.使用反相高效液相色谱仪测定空白辅料溶液的色谱图和供试品溶液的色谱图，分别如图1和图2。
43.测定条件：色谱柱为waters xterrarp8，4.6
×
250mm，5μm，流动相的为乙腈水溶液，进行梯度洗脱，其中，乙腈：水＝(53：47)，流速为1.0ml/min，色谱柱柱温为35℃，紫外检测器检测波长为251nm，进样量为10ul。
44.由图1和图2可知，氟雷拉纳制剂的高效液相色谱图中氟雷拉纳的峰型良好，空白辅料并不干扰氟雷拉纳含量检测，氟雷拉纳主峰与前后杂质达到基线分离，分离度大于1.5。
45.实施例2：
46.包括如下步骤：
47.1)配制氟雷拉纳的空白辅料溶液
48.取空白辅料160mg，精密称定至100ml容量瓶中，用乙腈溶剂稀释1000ml，摇匀，作为空白辅料溶液。
49.2)配制供试品溶液
50.取氟雷拉纳制剂适量(含氟雷拉纳100mg)，用乙腈溶剂稀释制成每1ml含氟雷拉纳500μg供试品溶液。
51.3)反相高效液相色谱测定
52.使用反相高效液相色谱仪测定空白辅料溶液的色谱图和供试品溶液的色谱图。
53.测定条件：色谱柱为waters xterrarp8，4.6
×
250mm，5μm，流动相的为乙腈水溶液，进行梯度洗脱，其中，乙腈：水＝(55：45)或乙腈：水＝(53：47)或，流速为1.0ml/min，色谱柱柱温为35℃，紫外检测器检测波长为251nm，进样量为10ul。
54.氟雷拉纳制剂的高效液相色谱图中氟雷拉纳的峰型良好，空白辅料并不干扰氟雷拉纳含量检测，氟雷拉纳主峰与前后杂质达到基线分离，分离度大于1.5。
55.实施例3：
56.1)配制氟雷拉纳的空白辅料溶液
57.取空白辅料160mg，精密称定至100ml容量瓶中，用乙腈溶剂稀释1000ml，摇匀，作为空白辅料溶液。
58.2)配制供试品溶液
59.取氟雷拉纳制剂适量(含氟雷拉纳100mg)，用乙腈溶剂稀释制成每1ml含氟雷拉纳500μg供试品溶液。
60.3)反相高效液相色谱测定
61.使用反相高效液相色谱仪测定空白辅料溶液的色谱图和供试品溶液的色谱图。
62.测定条件：色谱柱为waters xterrarp8，4.6
×
250mm，5μm，流动相的为乙腈水溶液，进行梯度洗脱，其中，乙腈：水＝(55：45)或乙腈：水＝(53：47)或，流速为1.0ml/min，色谱柱柱温为35℃，紫外检测器检测波长为251nm，进样量为10ul。
63.测定条件：色谱柱为waters xterrarp8，4.6
×
250mm，5μm，流动相的为乙腈水溶液，进行梯度洗脱，其中，乙腈：水＝(53：47)，流速为0.8ml/min或1.2ml/ml，色谱柱柱温为35℃，紫外检测器检测波长为251nm，进样量为10ul。
64.氟雷拉纳制剂的高效液相色谱图中氟雷拉纳的峰型良好，空白辅料并不干扰氟雷拉纳含量检测，氟雷拉纳主峰与前后杂质达到基线分离，分离度大于1.5。
65.实施例4：
66.1)配制氟雷拉纳的空白辅料溶液
67.取空白辅料160mg，精密称定至100ml容量瓶中，用乙腈溶剂稀释1000ml，摇匀，作为空白辅料溶液。
68.2)配制供试品溶液
69.取氟雷拉纳制剂适量(含氟雷拉纳100mg)，用乙腈溶剂稀释制成每1ml含氟雷拉纳500μg供试品溶液。
70.3)反相高效液相色谱测定
71.使用反相高效液相色谱仪测定空白辅料溶液的色谱图和供试品溶液的色谱图。
72.测定条件：色谱柱为waters xterrarp8，4.6
×
250mm，5μm，流动相的为乙腈水溶液，进行梯度洗脱，其中，乙腈：水＝(55：45)或乙腈：水＝(53：47)或，流速为1.0ml/min，色谱柱柱温为35℃，紫外检测器检测波长为251nm，进样量为10ul。
73.测定条件：色谱柱为waters xterrarp8，4.6
×
250mm，5μm，流动相的为乙腈水溶液，进行梯度洗脱，其中，乙腈：水＝(53：47)，流速为1ml/min，色谱柱柱温为30℃或40℃，紫外检测器检测波长为251nm，进样量为10ul。
74.氟雷拉纳制剂的高效液相色谱图中氟雷拉纳的峰型良好，空白辅料并不干扰氟雷拉纳含量检测，氟雷拉纳主峰与前后杂质达到基线分离，分离度大于1.5。
75.实施例5：检测方法的系统适用性试验
76.包括如下步骤：
77.1)配置标准品溶液
78.称取氟雷拉纳标准品适量，精密称定，加入溶剂使溶解并稀释制成每1ml含氟雷拉纳0.5mg溶液。
79.2)反相高效液相色谱测定
80.使用反相高效液相色谱仪测定标准品溶液的色谱图，如图3。
81.测定条件：色谱柱为waters xterrarp8，4.6
×
250mm，5μm，流动相为乙腈水溶液，进行梯度洗脱，其中，乙腈：水＝(53：47)，流速为1.0ml/min，色谱柱柱温为35℃，紫外检测器检测波长为251nm，进样量为10ul。
82.连续重复测定6次，结果如表1。由表1可知：重复进同一样品6次，峰面积的rsd％为0.05％，远小于药典中rsd％《2.0％的规定，这说明改方法系统适用性良好，试验可信度高。
83.表1
[0084][0085]
实施例6：检测方法的线性关系试验
[0086]
按照样品浓度为50％、80％、100％、120％和150％，分别称取氟雷拉纳标准品20-100mg至20ml容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为储备溶液，分别精密量取0.5ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.5ml至10ml容量瓶中，用溶剂定容至刻度，摇匀，得氟雷拉纳标准品浓度为0.25mg/ml、0.40mg/ml、0.50mg/ml、0.60mg/ml、0.75mg/ml，按照实施例1中的反相高效液相色谱的测试条件进行测定峰面积，结果如表2，并将其作为纵坐标，相应的浓度为横坐标绘制曲线，如图4。
[0087]
表2
[0088]
浓度(mg/ml)峰面积0.2541050940.465824350.582750120.698165840.7512405846
[0089]
由表3和图4可知：氟雷拉纳的峰面积与浓度呈现良好的线性关系，拟合得到的标准线性r2＝0.9998，符合药典规定r2≥0.99，这说明该检测方法在0.25～0.75mg/ml的浓度范围内线性良好。
[0090]
实施例7：重复性试验
[0091]
如实施例2中配置6份标准品溶液，并根据实施例2中的反相高效液相色谱法测定6份标准品溶液的色谱图，并计算峰面积，根据外标法计算制剂中氟雷拉纳含量，结果如表3。
[0092]
表3
[0093]
[0094]
由表3可知，依据本方法得到的氟雷拉纳制剂氟雷拉纳标示平均含量为98.4％，rsd为0.53％，符合药典中规定的rsd《2.0％，这说明该方法测定氟雷拉纳的重复性良好。
[0095]
实施例8：准确度试验
[0096]
1)配制标准品溶液；
[0097]
称取氟雷拉纳标准品适量，精密称定，加入溶剂使溶解并稀释制成每1ml含氟雷拉纳0.5mg溶液。
[0098]
2)配制空白辅料溶液；
[0099]
精密称取空白辅料65.12mg，置50ml量瓶中，加入溶剂溶解并稀释刻度，摇匀。
[0100]
3)配制供试品溶液；
[0101]
按照浓度为80％，100％，120％，并且每个样品浓度3个重复样品，分别精密称取氟雷拉纳标准品20.99mg、20.85mg、20.22mg、25.52mg、25.86mg、225.44mg、30.12mg、30.14mg、30.16mg置50ml量瓶中，再分别精密称取空白辅料65.12mg、65.14mg、65.25mg、66.01mg、64.98mg、65.02mg、65.12mg、65.52mg、65.42mg加入溶剂溶解并稀释刻度，摇匀。
[0102]
按照实施例1中的反相高效液相色谱的测定条件测定峰面积，根据外标法计算氟雷拉纳制剂中氟雷拉纳含量，结果如表4。
[0103]
表4
[0104][0105]
由表4可知，制剂中氟雷拉纳平均回收率为100.6％，再药典规定范围98.0％～102.0％内，rsd％为0.68％小于2.0％，说明采用本方法测定制剂中氟雷拉纳的含量准确可靠。
[0106]
对比例1：
[0107]
1)配制氟雷拉纳的空白辅料溶液
[0108]
取空白辅料160mg，精密称定至100ml容量瓶中，用乙腈溶剂稀释1000ml，摇匀，作为空白辅料溶液。
[0109]
2)配制供试品溶液
[0110]
取氟雷拉纳制剂适量(含氟雷拉纳100mg)，用乙腈溶剂稀释制成每1ml含氟雷拉纳500μg供试品溶液。
[0111]
3)反相高效液相色谱测定
[0112]
使用反相高效液相色谱仪测定空白辅料溶液的色谱图和供试品溶液的色谱图，图5。
[0113]
测定条件：色谱柱为waters xterrarp8，4.6
×
250mm，5μm，流动相的为乙腈水溶液，进行梯度洗脱，其中，乙腈：水＝(62：38)，流速为1.0ml/min，色谱柱柱温为35℃，紫外检测器检测波长为251nm，进样量为10ul。
[0114]
氟雷拉纳主峰与前后杂质达不到基线分离，分离度小于1.5。
[0115]
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。