一种液基细胞制片的方法与流程

1.本技术涉及细胞学检测技术领域，尤其是涉及一种液基细胞制片的方法。


背景技术：

2.宫颈癌是目前女性癌症中最常见的恶性肿瘤之一。早期诊断宫颈癌及癌前病变是提高宫颈癌治愈率及患者生存率的关键，细胞学检查是目前临床应用最广泛的筛查子宫颈癌的主要方法。它是以观察细胞结构和形态变化来诊断临床病症的一门学科。几十年来细胞学检查已成为宫颈癌的大规模普查和高危人群随访观察的主要方法，使中晚期宫颈癌发生率大幅度下降。细胞学检查主要有巴氏涂片法和液基细胞检测法，巴氏涂片法存在大量细胞的重叠以及杂质细胞过多，病理医生在判读时非常困难，因而其假阴性率。液基细胞检测法其涂片细胞重叠少、无退变或退变轻微，背景干净清晰，因而液基细胞学检查的敏感性和特异性均优于传统巴氏涂片。
3.目前液基细胞检测方法中，虽然可以避免大量细胞的重叠，但是仍旧无法解决标本内有大量红细胞、白细胞和粘液问题，这些残留的无效细胞和粘液不仅会影响观察，还容易使有效的宫颈细胞丢失。为了去除红细胞，白细胞和粘液，采用的方法主要有离心法和冲洗法，离心法可以基本去除粘液和白细胞，但是因为宫颈细胞与红细胞的比重相差较小，因而虽然有分界线，但是两者界线不清晰，实质上难以实现完全分离。冲洗法虽然能去除大部分红细胞和白细胞，但也会损失部分宫颈细胞。
4.针对上述相关技术，发明人认为目前液基细胞检测法中液基细胞纸片中存在着杂质细胞和粘液较多缺陷。


技术实现要素：

5.为了进一步提高液基细胞检查的精准度和效率，本技术提供一种液基细胞制片的方法。
6.本技术提供的一种液基细胞制片的方法，采用如下的技术方案：一种液基细胞制片的方法，包括以下步骤：s1：将液基样品放入到培养皿中，孵育后，切换至生理盐水体系，然后向培养皿中加入苯甲酸甲酯和甘油三苯酸甲酯组成的混合物，离心，然后用生理盐水冲洗掉上层的红细胞、白细胞和粘液；再然后用吸走表层液膜，底层即为处理后的液基样品；s2：向步骤s1中处理后的液基样品中加入细胞保存处理液，充分振荡，对细胞进行定型，得到定型处理后的液基样品；s3：将步骤s2中定型处理后的液基样品置于沉降仓中进行沉降，沉降后，去除上清液，然后进行巴氏染色，得到染色后的液基样品；s4：将步骤s3中染色后的液基样品进入离心机的制片仓，通过离心作用，在病理玻片上形成均匀的细胞层，封片后，即可用于检测。
7.通过采用上述技术方案，红细胞的密度介于1.085～1.12之间，白细胞和粘液的密
度是低于红细胞的，而液基细胞(上皮细胞、颈管细胞和底层细胞)的密度在1.21～1.25之间，其各种细胞之间的密度是存在差异的；因而本技术中苯甲酸甲酯和甘油三苯酸甲酯组成的混合物，调节其比例使其密度介于红细胞和液基细胞的密度之间，由于苯甲酸甲酯和甘油三苯酸甲酯都是疏水的，因而离心的过程中，其会形成4层，白细胞和粘液层、红细胞层、苯甲酸甲酯和甘油三苯酸甲酯形成的液膜层和液基细胞层，此时用生理盐水可以冲洗掉白细胞和粘液层以及红细胞层，而液膜层疏水的，其覆盖在液基细胞层上，可以保护液基细胞不被冲走。因为其液膜独特的疏水性，会形成一层薄膜，因而冲洗完毕后，只需采用移液枪置于膜层上，轻轻吸附，即可将整张膜去除。因而本技术中的方法，可以将大量的红细胞、白细胞以及粘液进行去除，避免这些杂质细胞的存在，影响液基细胞的观察。
8.作为优选，所述步骤s1中，苯甲酸甲酯和甘油三苯酸甲酯的质量比为(0.47～0.59):(0.41～0.53)；混合物的密度在1.14～1.17g/cm3；混合物配置时，是将甘油三苯酸甲酯加入到苯甲酸甲酯中，加热至70～80℃，使甘油三苯酸甲酯充分溶解，得到均匀的混合物。
9.通过采用上述技术方案，本技术中通过控制苯甲酸甲酯和甘油三苯酸甲酯的比例，可以使混合物的密度介于红细胞和宫颈细胞之间，因而可以更好的实现红细胞和宫颈细胞的分离；而且苯甲酸甲酯和甘油三苯酸甲酯的比例是非常关键，除了控制密度外，如果苯甲酸甲酯的含量过高，只会形成油状液体层，而不会形成液膜，因而冲洗上层细胞层时容易不稳定；如果甘油三苯酸甲酯含量过高，离心过程中，其容易析出，因而会有甘油三苯酸甲酯粉末颗粒进入到宫颈细胞层。
10.作为优选，所述步骤s1中，苯甲酸甲酯和甘油三苯酸甲酯组成的混合物加入量为液基样品生理盐水体系体积的0.2～0.3倍。
11.通过采用上述技术方案，混合物的加入量过少，形成的液膜过薄，不利于后续的冲洗步骤，混合物的加入量过多，因而混合物层较厚，基本只有表层会析出膜，下层仍会有部分呈油状的液体，不利于后续的分离。
12.作为优选，所述步骤s1中，离心的转速为1000～1200r/min；生理盐水冲洗时间为4～5min。
13.通过采用上述技术方案，通过控制离心的转速，在可以保证分层的同时，不影响细胞的形态；冲洗时间过短，上层杂质细胞没被冲洗干净，冲洗时间过长，容易将液膜冲坏。
14.作为优选，所述步骤s2中，每100ml细胞保存处理液，有以下组分组成：十二水磷酸氢二钠：2.5～3.1g；二水磷酸二氢钠：0.25～0.35g；乙醇20～30ml；甲醛1～5ml；氯化钠0.1～1g；二硫苏糖醇0.2～0.4g；谷氨酰胺0.03～0.05g；叶酸0.1～0.2g；加蒸馏水补充至100ml；处理后的液基样品和细胞保存处理液的体积比为1:2～4。
15.通过采用上述技术方案，磷酸氢二钠和磷酸二氢钠是作为酸碱缓冲液，有助于保持溶液恒定的ph值，使细胞不会在细胞固定中因ph变化而破裂；乙醇和甲醛能使细胞固定，同时有防腐功能，防止液基细胞保存液的变质，二硫苏糖醇可将粘附而在液基细胞上的粘液洗脱出来；谷氨酰胺和叶酸的相互配合，更好地保护细胞，维持细胞形态；氯化钠可以具有调节渗透压的作用，因而也可以维持细胞的形态。本技术中的细胞保存处理液，通过调节ph和渗透压等功能，可以使液基细胞保持较好的形态，避免了细胞的萎缩和肿胀破裂等形态变化情况的发生，维持细胞的稳定性，同时细胞保存处理液还可以实现细胞的固定，使细
胞易染色，从而提高细胞制片的清晰度，便于后续的病理检验工作。
16.作为优选，所述步骤s3中，巴氏染色的具体步骤为：向沉降后的液基样本中加入95％无水乙醇固定15～20min，蒸馏水清洗4～5次，接着置于苏木素染液中3～5min，清水冲洗2～3次，进行蓝化，接着95％的乙醇进行漂洗，置于橙黄染液中1～10s,接着95％的乙醇进行漂洗，再接着100％的乙醇漂洗，然后置于ea50染料中3～5min，接着95％的乙醇进行漂洗2次,100％的乙醇漂洗，置于无水乙醇中2～3min，接着置于二甲苯中2min。
17.通过采用上述技术方案，通过巴氏染色法可以实现液基细胞更好的染色。
18.所述步骤s4中，离心转速为700～800r/min。
19.通过采用上述技术方案，离心转速过快细胞容易重叠堆积，离心速率过慢，细胞不够密集。
20.综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：1.本技术方法中通过在液基样品的生理盐水体系中加入苯甲酸甲酯和甘油三苯酸甲酯组成的混合物，通过离心作用，是杂质细胞与液基细胞实现有效的分离，从而可以避免这些杂质细胞的存在，影响液基细胞的观察，提高检测的效率和准确率。
21.2.本技术中通过苯甲酸甲酯和甘油三苯酸甲酯的比例，可以控制液膜的形成，从而更好的实现杂质的去除。
22.3.本技术中配置了细胞保存处理液，可以使液基细胞保持较好的形态，避免了细胞的萎缩和肿胀破裂等形态变化情况的发生，维持细胞的稳定性，同时细胞保存处理液还可以实现细胞的固定，使细胞易染色，从而提高细胞制片的清晰度，便于后续的病理检验工作。
具体实施方式
23.制备例：苯甲酸甲酯和甘油三苯酸甲酯组成的混合物的制备制备例1将5.6g甘油三苯酸甲酯加入到5g苯甲酸甲酯，加热至75℃，并保温30min，甘油三苯酸甲酯充分溶解，得到均匀的混合物1。其密度为：1.169g/cm3。
24.制备例2将4.4g甘油三苯酸甲酯加入到5g苯甲酸甲酯，加热至75℃，并保温30min，甘油三苯酸甲酯充分溶解，得到均匀的混合物2。其密度为：1.160g/cm3。
25.制备例3将3.9g甘油三苯酸甲酯加入到5g苯甲酸甲酯，加热至72℃，并保温30min，甘油三苯酸甲酯充分溶解，得到均匀的混合物2。其密度为：1.156g/cm3。
26.制备例4将3.5g甘油三苯酸甲酯加入到5g苯甲酸甲酯，加热至72℃，并保温30min，甘油三苯酸甲酯充分溶解，得到均匀的混合物2。其密度为：1.152g/cm3。
27.实施例1s1：将液基样品放入到培养皿中，孵育后，切换至生理盐水体系，然后向培养皿中加入混合物1(混合物1的体积为液基样品生理盐水体系体积的0.2倍)，1000r/min离心1min，可以看到其明显分为4层，然后用生理盐水冲洗掉上层的红细胞、白细胞和粘液，冲洗
时间为5min；清洗完毕后，用移液枪置于液膜上轻轻吸走液膜层，剩余的底层即为处理后的液基样品。
28.s2：向步骤s1中处理后的液基样品中加入其体积3倍的细胞保存处理液，充分振荡30min，是细胞分散开来，并对细胞进行定型，得到定型处理后的液基样品；其中：细胞保存处理液的组成为：十二水磷酸氢二钠：2.90g；二水磷酸二氢钠：0.30g；乙醇25ml；甲醛3ml；氯化钠0.5g；二硫苏糖醇0.3g；谷氨酰胺0.04g；叶酸0.1g；加蒸馏水补充至100ml。
29.s3：将步骤s2中定型处理后的液基样品置于沉降仓中进行沉降，向沉降后的液基样本中加入95％无水乙醇固定20min，蒸馏水清洗4次，接着置于苏木素染液中5min，清水冲洗3次，进行蓝化，接着95％的乙醇进行漂洗，置于橙黄染液5s，接着95％的乙醇进行漂洗，再接着100％的乙醇漂洗，然后置于ea50染料中4min，接着95％的乙醇进行漂洗2次，100％的乙醇漂洗，置于无水乙醇中2min，接着置于二甲苯中2min，得到得到染色后的液基样品；s4：将步骤s3中染色后的液基样品进入离心机的制片仓，控制离心机的转速800r/min，在病理玻片上形成均匀的细胞层，封片后，用于镜下检查。
30.实施例2与实施例1基本一致，只是将混合物1采用制备例2中的混合物2替换。
31.实施例3与实施例1基本一致，只是采用混合物1采用制备例3中的混合物3替换。
32.实施例4与实施例1基本一致，只是采用混合物1采用制备例4中的混合物4替换。
33.对比例1与实施例3基本一致，区别点在于，将液基样品放入到培养皿中，孵育后，切换至生理盐水体系，1000r/min离心1min，然后用生理盐水冲洗掉红细胞、白细胞上层，冲洗时间为5min；冲洗完毕后，剩余的底层即为处理后的液基样品。
34.对比例2与实施例3基本一致，区别点在于，混合物3的体积为液基样品生理盐水体系体积的0.4倍；冲洗掉上层杂质细胞后，用移液枪吸走表层液膜后，还会有一层油性状液体漂浮在液基细胞膜层上，需要用生理盐水进行二次冲洗，将油性物质冲洗走。
35.对比例3与实施例3基本一致，区别点在于，细胞保存处理液的组成为：十二水磷酸氢二钠：2.90g；二水磷酸二氢钠：0.30g；乙醇25ml；甲醛3ml；氯化钠0.5g；加蒸馏水补充至100ml。
36.对比例4与实施例3基本一致，区别点在于，步骤s1中的冲洗时间为8min，液膜边缘有破裂的缺口。
37.对实施例1～4和对比例1～3的镜检情况如表1所示：表1
表中少量代表15～40个；极少代表15个以下，多表示在50个以上，偏少表示在40个以下。
38.从实施例1～4的数据上来看，除了实施例1出现了少量的红细胞，实施例2～4中都是没有红细胞和白细胞的出现，说明本技术中的混合物可以很好的将红细胞、白细胞与液基细胞进行分离；而实施例1中出现了1～2个红细胞，可能是因为实施例1中混合物1的密度与红细胞过于接近，因而没有完全的将红细胞分离开来，又或者是冲洗过程中，操作失误，使得少量红细胞进入到液基细胞层。
39.对比例1中主要是采用生理盐水冲洗的方式，去除红细胞，因为没有液膜的存在，其在冲洗过程中红细胞会重新混入液基细胞中，而且还会使得部分液基细胞被冲走，导致上皮细胞、颈管细胞和底层细胞会有所减少。
40.对比例2中主要是增加了混合物3的加入量，加入量过多，导致除了表层有液膜外，液膜下还有少量的油状液体，因而需要进行二次冲洗，二次冲洗会导致少量液基细胞会被冲洗走，因而导致液基细胞偏少。
41.对比例3中主要是细胞保存处理液中减少了二硫苏糖醇、谷氨酰胺和叶酸，因而影响了细胞的形状，导致少量细胞薄膜破裂以及染色不均。
42.对比例4中冲洗时间过长，导致液膜边缘出现破裂，因而导致部分液基细胞被冲走，而且少量的红细胞会渗入到液基细胞中。
43.实施例5s1：将液基样品放入到培养皿中，孵育后，切换至生理盐水体系，然后向培养皿中加入混合物2(混合物2的体积为液基样品生理盐水体系体积的0.3倍)，1200r/min离心30s，可以看到其明显分为4层，然后用生理盐水冲洗掉上层的红细胞、白细胞和粘液，冲洗时间为4min；清洗完毕后，用移液枪置于液膜上轻轻吸走液膜层，剩余的底层即为处理后的液基样品。
44.s2：向步骤s1中处理后的液基样品中加入其体积2倍的细胞保存处理液，充分振荡30min，是细胞分散开来，并对细胞进行定型，得到定型处理后的液基样品；其中：细胞保存处理液的组成为：十二水磷酸氢二钠：3.1g；二水磷酸二氢钠：0.35g；乙醇20ml；甲醛2ml；氯化钠0.2g；二硫苏糖醇0.4g；谷氨酰胺0.03g；叶酸0.2g；加蒸馏水补充至100ml。
45.s3：将步骤s2中定型处理后的液基样品置于沉降仓中进行沉降，向沉降后的液基样本中加入95％无水乙醇固定15min，蒸馏水清洗5次，接着置于苏木素染液中3min，清水冲洗2次，进行蓝化，接着95％的乙醇进行漂洗，置于橙黄染液8s，接着95％的乙醇进行漂洗，再接着100％的乙醇漂洗，然后置于ea50染料中5min，接着95％的乙醇进行漂洗2次，100％的乙醇漂洗，置于无水乙醇中3min，接着置于二甲苯中2min，得到得到染色后的液基样品；s4：将步骤s3中染色后的液基样品进入离心机的制片仓，控制离心机的转速700r/min，在病理玻片上形成均匀的细胞层，封片后，用于镜下检查。
46.实施例6s1：将液基样品放入到培养皿中，孵育后，切换至生理盐水体系，然后向培养皿中加入混合物3(混合物3的体积为液基样品生理盐水体系体积的0.3倍)，1100r/min离心45s，可以看到其明显分为4层，然后用生理盐水冲洗掉上层的红细胞、白细胞和粘液，冲洗时间为5min；清洗完毕后，用移液枪置于液膜上轻轻吸走液膜层，剩余的底层即为处理后的液基样品。
47.s2：向步骤s1中处理后的液基样品中加入其体积4倍的细胞保存处理液，充分振25min，是细胞分散开来，并对细胞进行定型，得到定型处理后的液基样品；其中：细胞保存处理液的组成为：十二水磷酸氢二钠：2.5g；二水磷酸二氢钠：0.25g；乙醇30ml；甲醛4ml；氯化钠0.8g；二硫苏糖醇0.2g；谷氨酰胺0.05g；叶酸0.1g；加蒸馏水补充至100ml。
48.s3：将步骤s2中定型处理后的液基样品置于沉降仓中进行沉降，向沉降后的液基样本中加入95％无水乙醇固定15min，蒸馏水清洗4次，接着置于苏木素染液中5min，清水冲洗3次，进行蓝化，接着95％的乙醇进行漂洗，置于橙黄染液10s，接着95％的乙醇进行漂洗，再接着100％的乙醇漂洗，然后置于ea50染料中3min，接着95％的乙醇进行漂洗2次，100％的乙醇漂洗，置于无水乙醇中3min，接着置于二甲苯中2min，得到得到染色后的液基样品。
49.s4：将步骤s3中染色后的液基样品进入离心机的制片仓，控制离心机的转速800r/min，在病理玻片上形成均匀的细胞层，封片后，用于镜下检查。
50.实施例7s1：将液基样品放入到培养皿中，孵育后，切换至生理盐水体系，然后向培养皿中加入混合物4(混合物4的体积为液基样品生理盐水体系体积的0.3倍)，1200r/min离心45s，
可以看到其明显分为4层，然后用生理盐水冲洗掉上层的红细胞、白细胞和粘液，冲洗时间为5min；清洗完毕后，用移液枪置于液膜上轻轻吸走液膜层，剩余的底层即为处理后的液基样品。
51.s2：向步骤s1中处理后的液基样品中加入其体积4倍的细胞保存处理液，充分振25min，是细胞分散开来，并对细胞进行定型，得到定型处理后的液基样品；其中：细胞保存处理液的组成为：十二水磷酸氢二钠：2.8g；二水磷酸二氢钠：0.31g；乙醇25ml；甲醛3ml；氯化钠0.2g；二硫苏糖醇0.4g；谷氨酰胺0.05g；叶酸0.2g；加蒸馏水补充至100ml。
52.s3：将步骤s2中定型处理后的液基样品置于沉降仓中进行沉降，向沉降后的液基样本中加入95％无水乙醇固定20min，蒸馏水清洗5次，接着置于苏木素染液中3min，清水冲洗3次，进行蓝化，接着95％的乙醇进行漂洗，置于橙黄染液2s，接着95％的乙醇进行漂洗，再接着100％的乙醇漂洗，然后置于ea50染料中5min，接着95％的乙醇进行漂洗2次，100％的乙醇漂洗，置于无水乙醇中3min，接着置于二甲苯中2min，得到得到染色后的液基样品。
53.实施例8s1：将液基样品放入到培养皿中，孵育后，切换至生理盐水体系，然后向培养皿中加入混合物1(混合物1的体积为液基样品生理盐水体系体积的0.3倍)，1200r/min离心45s，可以看到其明显分为4层，然后用生理盐水冲洗掉上层的红细胞、白细胞和粘液，冲洗时间为5min；清洗完毕后，用移液枪置于液膜上轻轻吸走液膜层，剩余的底层即为处理后的液基样品。
54.s2：向步骤s1中处理后的液基样品中加入其体积2倍的细胞保存处理液，充分振30min，是细胞分散开来，并对细胞进行定型，得到定型处理后的液基样品；其中：细胞保存处理液的组成为：十二水磷酸氢二钠：2.8g；二水磷酸二氢钠：0.31g；乙醇25ml；甲醛3ml；氯化钠0.2g；二硫苏糖醇0.4g；谷氨酰胺0.05g；叶酸0.2g；加蒸馏水补充至100ml。
55.s3：将步骤s2中定型处理后的液基样品置于沉降仓中进行沉降，向沉降后的液基样本中加入95％无水乙醇固定20min，蒸馏水清洗5次，接着置于苏木素染液中3min，清水冲洗3次，进行蓝化，接着95％的乙醇进行漂洗，置于橙黄染液2s，接着95％的乙醇进行漂洗，再接着100％的乙醇漂洗，然后置于ea50染料中5min，接着95％的乙醇进行漂洗2次，100％的乙醇漂洗，置于无水乙醇中3min，接着置于二甲苯中2min，得到得到染色后的液基样品。
56.对实施例1～4和对比例1～3的镜检情况如表2所示：表2
从实施例5～8中的镜检情况来看，制片情况都比较理想，基本没有红细胞和白细胞的干扰，且液基细胞损失基本比较少，可以保证镜检的精准度和效率。
57.实施例8中也是采用混合物1进行分层，从其结果看，将其加入比例调整是0.3倍，可以使得液膜更完整，因而实施例8中没有红细胞的出现。所以在实施例1的基础上，调整加入比例，也可以更好的去除红细胞。
58.以上均为本技术的较佳实施例，并非依此限制本技术的保护范围，故：凡依本技术的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本技术的保护范围之内。