专利名称：进行血细胞记数的方法
技术领域：
本发明涉及分析全血样品的方法和装置，并且涉及评定全血样品中的组分(例如白细胞、血小板等)的方法和装置。
分析血液学中的最近进展已增大了可从患者血样获得的信息的数量和质量。结果，医疗界在应用患者血样作为诊断工具方面的兴趣也增大了。然而，分析血样的方法并非在各方面都能跟上可获得的信息。历史上，血样是这样评定的将少量未稀释的血液涂抹在载玻片上，干燥，固定和染色，再在显微镜下检测该涂抹物。从这种涂抹物可获得合理的结果，但数据的准确性和可靠性则主要取决于技术员的经验和技术。此外，血液涂抹物既耗人力又使成本过高，所以，一般不利于商用。
评定全血样品的另一已知方法包括稀释一定体积的全血，将它放入样品室，然后，人工评定稀释后样品中的组成细胞。有必要进行稀释，因为全血中红细胞(RBC’s)的数量和浓度都大大超过其它组成细胞。在来自典型个体的全血样品中，例如，有大约4．5×106个RBC’s／微升(μl)血样，但每μl血样只有大约0．25×106个血小板和0．007×106个白细胞(WBC’s)。要测定WBC数，必须在大约一份血液比二十份稀释剂(1∶20)至大约1∶256稀释度的范围内稀释全血样品，这取决于应用的确切技术，并且，一般还有必要用一种或多种试剂选择性地溶解RBC’s。溶解RBC’s有效地从视野除去它们，这样就能看见WBC’s。要测定血小板数，必须在大约1∶100至大约1∶50，000的范围内稀释血样。不过，血小板计数不需要溶解样品中的RBC’s。这种评定全血样品的方法一个缺点是稀释过程既费时又昂贵。此外，往全血样品中添加稀释剂会增大样品数据的错误可能性。
一种评定血样的现代方法是阻抗或光学流式细胞仪。流式细胞仪涉及使稀释的血样通过一个或多个小直径孔循环，每个孔邻接一个阻抗型或光学型传感器，随着组成细胞通过单行孔，所述传感器就评定组成细胞。此处又一次必须稀释血样以便调节相对于WBC’s和血小板来说多得多的RBC’s数。尽管比前述方法更方便且更稳定，但流式细胞仪也具有数个缺点。这些缺点的一些来自需要将样品带到传感器装置的管道，以及需要控制流过传感器装置的流体流速的流体控制器。准确控制样品流动对操作流式细胞仪来说极为重要。流式细胞仪中的管道可能而且常常会渗漏，很可能危及仪器的准确性和安全性。另一方面，流体流动控制器和稀释器件需要定期再校准。对再校准的需要说明，就目前很多可获得的应用流式细胞仪的血液学分析仪来说，存在可能的不准确结果和不希望的操作费用。另一个缺点是需要的试剂量。由于应用大稀释比率，所以需要相应大量的液体试剂。大试剂量增大了测试费用并引起废物处理问题。
细胞分析的另一种方法是容量毛细管扫描法(volumetric capillaryscanning)，如美国专利Nos．5，547，849和5，585，246中概述的那样，例如，其中，将相关未稀释的全血样品置于已知容积和厚度的毛细管中，当血液呈静止状态时检测。该方法通过限定扫描波长(在那些波长时RBC’s显得较透明)处理存在的RBC’s，而且，它需要处理样品以致RBC’s在检测过程中不凝聚。所以，该方法限于更长波长荧光的应用，并且，对于RBC’s和血小板的检测或任何细胞形态学的检测没有保证。
需要评定基本上未稀释的抗凝全血样品的方法和装置，所述方法和装置1)能提供准确的结果；2)在分析前不需要除去RBC’s；3)能应用宽范围的样品检测的光激发源；4)不应用大量试剂；5)在分析过程中不需要样品流体流动；6)能分析样品中的全部或几乎全部细胞和粒子；以及7)是成本低的。
因此，本发明的一个目的是提供一种准确评定基本上未稀释的抗凝全血样品组分的方法。
另一个目的是提供评定全血样品的方法和装置，所述方法和装置不需要很多稀释。
又一个目的是提供评定全血样品的方法和装置，所述方法和装置不需要应用大量液体试剂。
又一个目的是提供评定全血样品的方法和装置，所述方法和装置不要求样品流体在评定过程中流动。
又一个目的是提供评定全血样品的方法和装置，所述方法和装置不需要在分析前除去大部分RBC’s。
又一个目的是提供评定样品的方法和装置，所述方法和装置能评定样品中的全部或几乎全部组分。
又一个目的是提供使用简便的评定全血样品的方法和装置。
本发明涉及用于检测盛于室内的静止的、基本上未稀释的抗凝全血样品并从该样品获取信息的方法和装置。本发明应用的术语“基本上未稀释的”描述了被不高于约1∶1稀释(优选小得多的稀释度)的血样。通常，实施本发明方法中将应用的仅有试剂是染料、染色剂和抗凝剂，这些试剂不是为了稀释样品而添加的，而是为了产生便利手头试验的反应、效果等而添加的。
按本发明，提供了一种评定基本上未稀释的抗凝全血样品的组分的方法，该方法包括如下步骤a)提供一个样品室；b)将敏感着色剂与全血样品掺和；c)将掺和的样品放入样品室；d)将掺和的样品在室内保持静态直至样品中形成红细胞钱串和陷窝；以及e)评定陷窝中分布的靶组分。本说明书中应用的术语“着色剂”被定义为这样的任意试剂它通过荧光发射或者通过吸收特定波长的光产生可通过所述装置定量分析的敏感信号。
本发明方法的一个优点在于，提供了一种评定基本上未稀释的抗凝全血样品组分的方法，该方法提供准确信息。具体地说，该方法不需流体流动控制器和样品稀释，所以避免了与它们相关的错误可能性。
本方法的另一个优点在于，可以评定抗凝全血样品中的组分但基本上不需稀释该样品。本方法需要往全血样品中添加较少量的敏感着色剂，于是能使样品保持基本上未稀释。从而避免了与稀释相关的费用和问题。例如，借助本发明的方法，可应用与大约10μl用盐水稀释的着色剂或小于1μl干试剂掺和的、100μl以内的血样而获得有用的信息。
又一个优点在于，当评定基本上未稀释的抗凝全血样品的组分时，本发明的方法不需要大量试剂。本领域技术人员将认识到，试剂量的减少有助于减少分析的原料费用和分析后用过的试剂的处理费用。
本方法的又一个优点在于，不需要样品流体流动。本方法能使血样在静止(或“基本上未运动的”)状态下被评定。血样中仅有的运动将是样品内构成组分的布朗运动，该运动不妨碍本发明装置的应用。结果，避免了管道渗漏和与这种渗漏相关的任何环境问题和／或安全问题。此外，在静止状态评定样品还避免了流体流动控制器的应用，从而免除购买和维护这类控制器的费用。本领域技术人员应认识到，与很多流式细胞仪相关的维护费用是可观的，所以，免除那些费用是一个明显的优点。
根据如附图所阐释的本发明最佳实施方案的详细描述，将使本发明的这些和其它目的、特征与优点变得明显。
图1是一种样品室的透视图。
图2是一种样品室的剖视图，它包括倾斜的第二块平壁。在第一块壁和第二块壁之间形成了直通平面(through-plane)厚度梯度。
图3是一种样品室的剖视图，它包括位于具有多级梯阶的第一块壁上面的第二块平壁。所述多级梯阶在不同的直通平面厚度提供多个室区。
图4是一种样品室的剖视图，它具有位于第一块壁上面的第二块平壁，第一块壁展示的一个表面与第二块平壁成一定角度。在第一块壁和第二块壁之间形成了直通平面厚度梯度。
图5是一种样品室的示意图，它阐释了在形成红细胞钱串和陷窝之前的基本上未稀释的抗凝全血样品形象化不透明外观。
图6是一种样品室的示意图，它阐释了在室内静止期后形成的在基本上未稀释的抗凝全血样品中的红细胞钱串和陷窝的外观。
与目前可获得的评定方法和装置相比，下文描述的评定基本上未稀释的抗凝全血样品中的白细胞(WBC’s)、血小板和其它全血成分的方法提供了很多优点。本方法包括如下步骤a)提供一个样品室10；b)将敏感着色剂与全血样品掺和；将掺和的样品放入样品室10；d)将掺和的样品在室10内保持静态直至样品中形成红细胞钱串30和陷窝32(见图6)；以及e)评定陷窝32中的一种或多种靶组分。
参照图1～4，样品室10包括第一块壁16和透明的第二块壁18。16、18这两块壁被具有可检测大小的直通平面厚度20彼此隔离。本文应用的术语“直通平面厚度”表示相应于第一块壁16的内表面22和第二块壁18的内表面24之间最短距离的视线。在第一个实施方案中(图2)，16、18这两块壁基本上都是平的，并且彼此平行。在第二个实施方案中(图2和4)，16、18这两块壁彼此趋向汇合，于是形成直通平面厚度20梯度。第二个实施方案的16、18这两块壁可能彼此相交(此时直通平面厚度20等于零)或者16、18这两块壁被最小距离地隔离。在第三个实施方案中(图3)，16、18这两块壁中的一块或两块包括一级或多级梯阶26。每级梯阶26产生具有不同的直通平面厚度20的独立区。在全部实施方案中，合适的话可应用分隔物28以便产生和／或保持16、18这两块壁之间的直通平面厚度20，而16、18这两块壁(或者梯阶区26)可以是基本上平的或弓形的。
16、18这两块壁之间的直通平面厚度20可通过数学法和／或光学法测定或者应用已知的参比物比较法测定。例如，如果16、18这两块壁的斜率都是已知的，并且16、18这两块壁彼此接触(或者隔离已知量；例如分隔物28)，那么，可通过数学法计算任何选定点处(给定离接触点(或分隔物28)的距离)的直通平面厚度20。还可应用光学法(包括但不限于干涉量度学、聚焦显微镜检术等)测定直通平面厚度20。关于测定直通平面厚度20的方法的更详细描述可见于美国专利申请No．＿(代理人案卷号为UFB-013)。不管应用哪种方法，在室10的制造过程中，都可以固定和标记该室的直通平面厚度20，或者可在加进样品前或加进样品后的更晚时间点(例如在最终用户的)测定直通平面厚度20。通常，靶组分的尺寸和样品的血细胞比容决定最有利的直通平面厚度20。下文将详细讨论组分和直通平面厚度20之间的关系。
将全血样品与一定量至少一种足以使细胞或粒子得以观察的敏感着色剂掺和。该敏感着色剂可以是这样的任何物质1)区别全血样品中的靶组分；以及2)当掺和时基本上不稀释全血样品。一个敏感着色剂的实例是荧光最亮超活染色剂，例如吖啶橙、碱性橙-21，或是能应用荧光显微镜观察的类似染料。在一些情况下，可应用一种着色剂鉴定数种组分。在其它情况下，可应用多种着色剂区分多种组分。可通过添加另一种敏感着色剂而同时进行其它组分的评定，例如美国专利申请No．＿(代理人案卷号为UFB-016)中描述的那些。可这样进行敏感着色剂的添加往全血样品中添加少量呈液体形式的敏感着色剂，于是最小程度地稀释样品，或者可添加呈干燥形式(例如小片)的着色剂。另一种掺和敏感着色剂与全血样品的方法是在样品室10的基面上干燥所述着色剂。当将全血样品加进室10时，着色剂就扩散入样品。
将一定量多到足以接触室的两块壁16和18的掺和后的全血样品加进室10。可通过各种方法(包括囊、毛细作用的应用)将样品加进室10。使样品溅出的可能性减至最小的方法和装置从环境和安全方面考虑是优选的。
参照图5和6，进入室10之后，短时间地将样品保持静止，使之形成红细胞钱串30和陷窝32(见图6)。如前所述，血样中仅有的运动是样品的构成组分的布朗运动，该运动不妨碍本发明装置的应用。红细胞钱串30是基本上不运动的抗凝全血中自发形成的红细胞(RBC’s)聚簇。陷窝是红细胞钱串30之间留下的空隙区。在抗凝全血中自然形成红细胞钱串30和陷窝32，因为聚集RBC’s的吸引力迫使其它组分[例如WBC’s34和血小板36(见图6)]进入陷窝32(它们在这里被评定)。将全血样品保持基本上不运动达大约15～30秒钟通常适合使红细胞钱串30和陷窝32形成，但该时间可随样品的不同而变。还可通过已知聚集剂促进红细胞钱串30的形成，此时，RBC’s的聚簇应被称为团聚体。这类聚集剂的实例有葡聚糖，polybrene和这两种物质的混合物，抗常规红细胞抗原的抗体，以及植物凝集素等。
被评定的全血样品的直通平面厚度20在评定样品组分中极为重要。例如，如果通过显微镜检测一层100μ(1μ=1×10-6米)厚的基本上未稀释的抗凝全血，该样品会显得不透明(如图5所示)，因为不管是否让RBC’s形成红细胞钱串30，光线都不能充分地穿透该层。然而，如果将样品层厚度减小到大约小于70μ，优选减小到4μ和50μ之间，将会有足量的光线通过，以致陷窝32显得象清澈的湖，在陷窝内可以区分和评定WBC’s34和血小板36。使得能评定陷窝32中的组分的最适样品层厚度将取决于样品的初始血细胞比容。该血细胞比容(它表示作为总血液体积百分数的RBC’s的数值)与最适样品层厚度负相关；即，比典型血细胞比容更高的值通常关联比典型最适样品层更薄的值。但是，在所有情况下，样品层必须足够厚以便提供合理的粒子或细胞数。应注意，并非每种有意义的单一组分都可能被迫使进入陷窝32。如果统计上或临床上不显著数量的组分被RBC团聚体遮蔽，并非本发明无用。还可能有一种或多种有意义的组分处于RBC’s的聚集体上面，但由于这些组分将被观察到(就立式显微镜来说)，所以它们将通过荧光进行完全评定。
靶组分可应用各种技术评定。例如，如果用荧光染料将靶组分着色，就可用可商购的荧光显微镜检测陷窝32。荧光显微镜将照射与靶组分相互作用的荧光染料，从而在样品中辨别它。荧光显微镜产生的图像可用图像分解器(例如CCD摄像机)记录，该图像可被人工评定，或者可将图像数字化处理而以电子文件形式储存。可应用分析软件解释该电子文件，所述分析软件具有例如鉴定特定组分、计算特定组分的出现率和评定所述组分的特征的能力。一个可商购的分析软件实例是由Signal Analytics Corporation of Vienna，VA，U．S．A．出售的软件，或者其它这样的图像处理系统。关于这种图像评定系统的更详细描述提供于本申请人的共同未决的美国专利申请No．＿(代理人案卷号为UFB-017)中。
如下实施例将阐述如何能应用本发明方法和装置评定各个全血样品组分
图5描绘了刚好将样品加进室10后样品的一个视区38，此时，当用透射光或者更优选地通过落射荧光检测时，样品显得不透明。不透明的外观是由RBC’s35引起的，它在形成红细胞钱串30之前形成重叠的物质。尽管样品视区38具有不透明的外观，但着色剂能使一些WBC’s34隐约可辨。图6示出基本上静止放置大约三十(30)秒钟后同样的室10。RBC’s35已自发簇集成红细胞钱串30，在红细胞钱串30之间留下陷窝32。就在这些陷窝32中可以识别和评定其它全血样品组分(例如WBC’s34和血小板36)。如果需要WBC34数目，可以评定具有20μ的直通平面厚度20的室10区内具有一平方毫米剖面面积的视区38(它含0．02μl体积的全血样品)。选定0．02μl样品而保持WBC’s34合理的数量；常规全血样品含大约7，000个WBC’s／μl样品，所以0．02μl常规全血样品含大约140个WBC’s。应计数一些这样的视区38直至计数了足够的细胞而获得具有充分的统计准确性的数值，实际上它大约是1000个细胞。如果要探寻另外的WBC34信息，可在该室体积内进一步评定WBC’s34(淋巴细胞、粒细胞、单核细胞等)。例如，如果需要分清全血样品中WBC’s34的类别和／或它们的频率，就可应用有／无分析软件的图像分解器评定该WBC’s。可以从收集的数据确定分类计数。关于该方法的更详细描述给出于共同未决的美国专利申请No．＿(代理人案卷号为UFB-011)中。
如果在20μ的室直通平面厚度处，样品的陷窝32区显得部分地不透明，也许是由于比典型血细胞比容更高的缘故，可能需要在具有小于20μ的直通平面厚度的样品室10中评定样品视区38。另一方面，如果样品的血细胞比容低于典型值，可能有利的是应用具有大于20μ的直通平面厚度20的样品视区38，因为各组分的群体可能更大。还可能改变样品的直通平面厚度20，作为增大或减小组分群体的方法。
虽然就其详细的实施方案展示和描述了本发明，但本领域技术人员会懂得，可对其形式和细节作各种改变而不会偏离本发明的精神和范围。例如，样品室被描述为具有第一块壁和透明的第二块壁。如果用透光度代替荧光作为检测样品的机理，那么，第一块壁和第二块壁都应是透明的。
权利要求书按照条约第19条的修改1．一种评定基本上未稀释的抗凝全血样品中的白细胞组分和／或血小板组分的方法，所述方法包括如下步骤a)提供一个在第一块壁和透明的第二块壁之间形成的样品室，所述两块壁在所述室的第一区内被第一个直通平面厚度隔离；b)产生一种着色剂与血样的掺和物，其中，所述着色剂区分血样中的一种或多种所述组分，所述掺和物是在所述室的外面或里面产生的，并且，当该掺和物处于所述室里面时，它与所述室的所述第一区内该室的所述第一块壁和第二块壁接触；c)将所述掺和物在所述室内静态保持到足以形成一个或多个红细胞钱串的预定的一段时间，该红细胞钱串与也是在所述静态掺和物中形成的陷窝邻接，并且其中，所述组分存在于所述陷窝中；d)检测一个或多个处于所述室的所述第一区内的视区；以及e)评定所述视区内陷窝中存在的所述白细胞组分和／或所述血小板组分。
2．权利要求1的方法，它进一步包括这一步骤选择性地确定所述室的第二区内一个或多个视区的位置，所述第二区的第二个直通平面厚度大于所述室的所述第一区内所述第一个直通平面厚度。
3．权利要求1的方法，它进一步包括这一步骤选择性地确定所述室的第二区内一个或多个视区的位置，所述第二区的第二个直通平面厚度小于所述室的所述第一区内所述第一个直通平面厚度。
4．权利要求1的方法，其中，所述第一个直通平面厚度不大于70μ。
5．权利要求1的方法，其中，所述第一个直通平面厚度不小于4μ。
6．权利要求1的方法，其中，所述第一个直通平面厚度不大于50μ。
7．权利要求1的方法，其中，所述掺和物是在所述室外面产生的。
8．权利要求1的方法，其中，所述掺和物是在所述室里面产生的。
权利要求
1．一种评定基本上未稀释的抗凝全血样品的组分的方法，所述方法包括如下步骤提供一个在第一块壁(16)和透明的第二块壁(18)之间形成的样品室(10)，所述两块壁在所述室的第一区内隔离第一个直通平面厚度(20)；将一种敏感着色剂与样品掺和，其中，所述着色剂区分样品中的一种或多种组分；将所述掺和后的样品放入所述室，使所述掺和后的样品与所述室的所述第一区内所述第一块壁和第二块壁接触；将所述掺和后的样品在所述室内静态保持一段时间；其中，在所述期间，在所述静态保存的样品内形成一个或多个与陷窝(32)邻接的红细胞钱串(30)，并且所述着色剂区分的组分存在于所述陷窝中；以及评定所述陷窝中一个或多个视区(38)内的所述区分的组分。
2．权利要求1的方法，其中，所述一个或多个视区(38)处于所述第一区内。
3．权利要求2的方法，它进一步包括如下步骤测定样品的血细胞比容；利用所述血细胞比容确定所述室(10)的一个区中所述一个或多个视区(38)的位置，所述室(10)具有被选定以增大所述陷窝(32)中所述组分的清晰度的直通平面厚度(20)。
4．权利要求1的方法，它进一步包括如下步骤选择性地确定所述室(10)的第二区内所述一个或多个视区(38)的位置，所述第二区的第二个直通平面厚度大于所述第一个直通平面厚度。
5．权利要求1的方法，它进一步包括如下步骤选择性地确定所述室(10)的第二区内所述一个或多个视区(38)的位置，所述第二区的第二个直通平面厚度小于所述第一个直通平面厚度。
6．权利要求1的方法，其中，所述第一个直通平面厚度不大于70μ。
7．权利要求6的方法，其中，所述第一个直通平面厚度不小于4μ。
8．权利要求7的方法，其中，所述第一个直通平面厚度不大于50μ。
9．权利要求1的方法，其中，在放入所述室(10)之前掺和所述敏感着色剂。
10．权利要求1的方法，其中，将所述敏感着色剂涂到所述室(10)内的一个表面上，于是该敏感着色剂从所述表面掺入所述样品。
全文摘要
提供了一种评定基本上未稀释的抗凝全血样品的组分的方法,该方法包括如下步骤:a)提供一个样品室(10);b)将一种敏感着色剂与全血样品掺和;c)将所述掺和后的样品放入该样品室;d)将所述掺和后的样品静态保持一段时间直至在所述样品内形成红细胞钱串(30)和陷窝(32);以及e)评定所述陷窝(32)中存在的靶组分。
文档编号G01N15/04GK1292872SQ99803739
公开日2001年4月25日 申请日期1999年3月5日 优先权日1998年3月7日
发明者斯蒂芬·C·沃德罗 申请人:斯蒂芬·C·沃德罗, 沃德罗合伙有限公司, 罗伯特·A·利费恩