一种甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种甲氨蝶岭检测试剂及其制备和检测方法，具体设及一种甲氨蝶岭 均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法。
【背景技术】
[0002] 甲氨蝶岭（Methotrexate)结构式如式（III)所示：
[0003]
【主权项】
1. 一种甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂，其特征在于，包括：抗甲氨蝶呤特异性抗体、用 于检测抗甲氨蝶呤特异性抗体-甲氨蝶呤复合物的指示试剂；上述抗甲氨蝶呤特异性抗体 由甲氨蝶呤免疫原免疫动物得到，甲氨蝶呤免疫原的结构式如式（I)所示： I
式中，载体为具有免疫原性的蛋白质；上述指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、 荧光试剂或化学发光试剂。
2. 根据权利要求1所述的甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂，其特征在于，上述指示试 剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸；所述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半 抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与甲氨蝶呤衍生物反应形成。
3. 根据权利要求2所述的甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂，其特征在于，上述甲氨蝶呤 衍生物的结构式如式（II)所示：
4. 甲氨蝶呤衍生物，结构式如式（II)所示：
5. 根据权利要求4所述的甲氨蝶呤衍生物，其特征在于，其合成路线为：
6. -种甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)权利要求4或5所述的甲氨蝶呤衍生物的合成与纯化，并进行结构鉴定； (2) 甲氨蝶呤免疫原的合成：使甲氨蝶呤衍生物的末端羧基与具有免疫原性的蛋白质 载体连接； (3) 用甲氨蝶呤免疫原免疫动物，制备并纯化抗甲氨蝶呤特异性抗体； (4) 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备：制备葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液， 制备甲氨蝶呤衍生物溶液，使葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与甲氨蝶呤的末端羧基连接，纯化连 接产物； (5) 甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂的制备： 试剂A的制备：由抗甲氨蝶呤特异性抗体和均相酶底物混合而成；试剂B的制备：由葡 萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成。
7. 根据权利要求6所述的一种甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在 于，所述的步骤（2)中，蛋白质载体为BSA，具体合成步骤如下： a. 称取2. 72g磷酸二氢钾、4. 26g磷酸氢二钠、8. 5g氯化钠、0. 95g氯化镁，共同溶解于 1L去离子水中，调节pH至7. 4,制成缓冲溶液A; b. 称取3mgBSA，室温下溶解于3mL上述缓冲溶液A中，制成BSA溶液； c. 称取3mg甲氨蝶呤衍生物，溶解于300ul上述缓冲溶液A中，制成甲氨蝶呤衍生物溶 液； d. 当上述甲氨蝶呤衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述BSA溶液中，然后将此 混合溶液在2-8°C下搅拌1小时； e. 将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析，透析后所得溶液即为甲氨蝶 呤免疫原溶液，在甲氨蝶呤免疫原溶液中加入质量分数〇. 1%的NaN3，于-20°C下储存。
8. 根据权利要求6所述的一种甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在 于，所述的步骤（4)具体过程为： a. 称取1. 09g磷酸二氢钾、1. 70g磷酸氢二钠、8. 5g氯化钠、0. 95g氯化镁，共同溶解于 1L去离子水中，调节pH至7. 4,制成缓冲溶液B; b. 称取3mg葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下溶解于3mL上述缓冲溶液B中，制成葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶溶液； c. 称取3mg甲氨蝶呤衍生物，溶解于300ul上述缓冲溶液B中，制成甲氨蝶呤衍生物溶 液； d. 当上述甲氨蝶呤衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 溶液中，然后将此混合溶液在2-8°C下搅拌1小时； e. 将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液B进行透析，透析后所得溶液即为葡萄 糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶液，在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物溶液中 加入质量分数〇. 5 %的BSA和质量分数0. 1 %的NaN3，于2-8 °C下储存。
9. 根据权利要求6所述的一种甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在 于，步骤（5)的具体过程如下： 试剂A的制备：将4. 036g11. 25mM的氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、1. 71lg 11. 25mM的葡萄糖-6-磷酸用1L55mM、pH= 8. 0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物； 将制备的抗甲氨蝶呤特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为 1:100 ?1:10000 ; 试剂B的制备：将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH= 8. 2 的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100?1:10000。
10.利用权利要求1至3任意一项所述的甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂的检测方法，其 特征在于，包括以下步骤： (1) 将待测样本与抗甲氨蝶呤特异性抗体接触； (2) 根据待测样本中甲氨蝶呤与抗甲氨蝶呤特异性抗体的结合情况，利用指示试剂判 断样本中甲氨蝶呤的含量； 所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液； 上述酶试剂包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸； 上述葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与甲氨蝶呤 衍生物反应形成，上述甲氨蝶呤衍生物的结构式如式（II)所示：
【专利摘要】本发明涉及一种甲氨蝶呤检测试剂及其制备和检测方法，具体涉及一种甲氨蝶呤均相酶免疫检测试剂及其制备和检测方法，包括：抗甲氨蝶呤特异性抗体、用于检测抗甲氨蝶呤特异性抗体-甲氨蝶呤复合物的指示试剂；上述抗甲氨蝶呤特异性抗体由甲氨蝶呤免疫原免疫动物得到。发明的有益之处在于：发明的甲氨蝶呤免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗甲氨蝶呤特异性抗体特异性强、效价高，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；含有上述抗甲氨蝶呤特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的甲氨蝶呤含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现甲氨蝶呤的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率有了较大的提高。
【IPC分类】G01N33-531, G01N33-544
【公开号】CN104569373
【申请号】CN201510039620
【发明人】虞留明, 卢忠心, 胡瑜, 娄金丽, 成志鹏
【申请人】苏州博源医疗科技有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月27日