计算不应低于10000。
[0029]Q Exactive?质谱系统配有HESI源，喷雾电压为3.0KV,毛细管温度和雾化器分别为350°C和250°C。鞘气和辅助气分别设为40和15psi，S - lens RF电压为50V。喷雾气和碰撞气均为氮气。使用校正溶液(含咖啡因、四肽MRFA和Ultramark 1621的混合溶液)三天校正一次质量轴。正负离子同时扫描，扫描方式米用full MS/dd-MS2模式，此模式包含一次一级全扫描(分辨率70 000FWHM)和一次数据依赖的二级扫描(分辨率17500FWHM)两个事件。full MS—级全扫描范围为m/z 100-400，自动增益控制AGC、最大注入时间IT分别设为1.0e6和100ms ；dd - MS 2数据依赖的二级扫描AGC设为2.0e 5，最大IT 设为 50ms,分离窗口 isolat1n window 设为 1.0m/z，underfill rat1 设为 1.0%,强度阈值 intensity threshold 设为 4.0e4,同位素排除 exclude isotopes 设为"on",动态排除 dynamic exclus1n 设为 10.0s。
[0030]1.3溶液配制
[0031 ] 1.3.1系列浓度混合对照品溶液
[0032]精密称取咖啡因、呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明适量置于25ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品储备液，浓度为400 μ g.mL-1?精密吸取上述储备液1.0mL于10mL量瓶中，加甲醇定容，得到10.0 μ g.ml/1的混合对照品储备液。同法逐步稀释，得到1.0，5.0，20，100，500ng.mL—1的系列浓度混合对照品溶液。
[0033]1.3.2供试品溶液的制备
[0034]若供试品为固体制剂，研细后，精密称取细粉约相当于一次服用量；若供试品为液体制剂，精密量取一次服用量，置50mL量瓶中，加甲醇适量，20°C恒温超声15分钟，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μπι微孔滤膜滤过，取续滤液即得。若供试品溶液浓度超出线性范围，则精密量取供试品溶液适量以初始流动相稀释至合适的浓度。
[0035]2 结果
[0036]2.1方法的建立
[0037]对照品中咖啡因、呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明的提取离子色谱图如图1所示，由图中可以观察到五种化合物均实现了良好的色谱分离。化合物理论质量数与实际测得的质量数相对偏差越小，筛查结果的可信程度越高。五种分析物的实测质量数和理论质量数偏差均小于5ppm，显示了 Orbitrap HRMS高度可靠的质量精度。我们将保留时间和一级质谱准确质量数作为鉴定依据，用于中成药和保健食品中非法添加物的快速筛查。对每种化合物的最佳归一化碰撞能量(NCE)进行优化，得到其二级碎片离子。图2给出五种减肥类化合物的二级质谱图。我们将二级碎片离子作为诊断离子，用以进一步确证化合物的存在。
[0038]2.2方法学验证
[0039]检出限:逐级稀释对照品溶液，按最低3倍信噪比(S/N彡3)计算检出限。呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明的检出限为0.1ng 咖啡因的检出限为0.5ng.πι?Λ表明了本方法具有很高的灵敏度，可实现对中成药和保健食品中减肥类非法添加物的痕量检测。
[0040]标准曲线:精密吸取系列浓度混合对照品溶液5 μ L进样，每个浓度进样3次，测定峰面积，取平均值。以峰面积Y为纵坐标，以对照品浓度X(ng.mL-1)为横坐标做线性回归分析，求算得相关系数r2均大于0.9988，显示了良好的线性关系。
[0041]准确度与精密度:准确度以浓度实测值和真实值比值的百分比来表示，精密度以浓度实测值的相对标准偏差(RSD)来表示。咖啡因、呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明的日内和H间准确度分别在97.3?103.1 %和95.6?104.8%之间，日内和日间精密度分别在0.96?2.8%和1.3?4.9%之间，结果令人满意。
[0042]回收率:本方法采用甲醇作为提取溶剂，五种化合物的的提取回收率均多91.2%，表明甲醇对咖啡因、呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明具有良好的提取效率。
[0043]2.3方法的应用
[0044]将得到的实验数据以Exact Finder 1.0软件进行快速筛查、确证和定量。在Screening Method中定义目标化合物数据库、定义目标识别或确认设置。我们以化合物保留时间和一级准确质量数作为鉴定依据，以二级碎片离子作为确认依据。样品与对照品中分析物的准确质量数偏差应< 5ppm，峰阈值、S/N信噪比阈值、诊断碎片离子数目分别设为50000、5和2，保留时间窗口设置为10s。在Quan Method中定义目标化合物类型、校正曲线计算选项、校正水平、质控水平。
[0045]在27种减肥类中成药和保健食品中共检出18批阳性样品，不符合率高达66.7%。其中，检出呋塞米样品I批，检出盐酸西布曲明样品6批，检出酚酞样品4批，同时检出咖啡因和盐酸西布曲明的样品2批，同时检出酚酞和盐酸西布曲明的样品5批。检出的非法添加物浓度很高(全部>10mg.g_1)，会对消费者的身体健康造成严重危害。Q - Orbitrap高分辨质谱法具有快速、准确、高灵敏度、高选择性的特点，为打击日益猖獗的非法添加行为提供了新工具、新技术。
【主权项】
1.一种减肥类中成药和保健食品中非法添加物的Q-Orbitrap高分辨质谱检测方法，其特征在 于包括以下步骤: . 1)采用Q-Orbitrap高分辨质谱仪，通过FullMS scan/dd - MS2 (Top N)扫描模式，正负离子同时检测，在一个分析周期12分钟内完成对样品中分析物的分离和高精度一级、二级质谱扫描，得到准确质量数和准确碎片离子信息； . 2)通过比较样品与减肥类化学成分对照品的色谱保留时间、一级质谱和二级质谱，确定样品中是否掺杂了减肥类化学药物，并对潜在的阳性样品进行定量分析；所述减肥类化学成分对照品为咖啡因、呋塞米、盐酸芬氟拉明、酚酞、盐酸西布曲明。 .3)将得到的实验数据以ExactFinder 1.0软件进行快速筛查、确证和定量。
2.根据权利要求1所述的减肥类中成药和保健食品中非法添加物的检测方法，其特征在于，所述高分辨质谱仪的质谱条件色谱条件为: 流动相:含0.1 %冰醋酸的1mmol -Γ1 ^ NH4AC (A)-甲醇(B)，梯度洗脱(O?0.5min，.20% B ;0.5 ?6.5min，20%?85% B ;6.5 ?9.0min,85% B ;9.I ?12min，20% B);流速:.300 μ L/min ;柱温:30°C ;自动进样器控温:20°C ;进样量:5 μ L ; 所述高分辨质谱仪的质谱条件: Full MS scan/dd - MS2 (Top N)扫描模式，正负离子同时检测；一级质谱扫描分辨率.70000FWHM, 二级质谱扫描分辨率17500FWHM ；full MS 一级全扫描范围为m/z 100-500，自动增益控制AGC、最大注入时间IT分别设为1.0e6和100ms ；dd - MS 2数据依赖的二级扫描AGC 设为 2.0e5，最大 IT 设为 50ms，分离窗口 isolat1n window 设为 1.0m/z，underfillrat1 设为 1.0%，强度阈值 intensity threshold 设为 4.0e4,同位素排除 excludeisotopes 设为 〃on〃，动态排除 dynamic exclus1n 设为 10.0s。
【专利摘要】本发明建立了一种减肥类中成药和保健食品中非法添加物的检测方法，其采用Q-Orbitrap高分辨质谱仪，通过Full MS scan/dd–MS2(Top N)扫描模式，正负离子同时检测，在一个分析周期完成对样品中分析物的分离和高精度一级、二级质谱扫描，得到准确质量数和准确碎片离子信息；通过比较样品与减肥类化学成分对照品的色谱保留时间、一级质谱和二级质谱，确定样品中是否掺杂了减肥类化学药物，并对潜在的阳性样品进行快速筛查、确证和定量。本发明具有灵敏度高、选择性好、确证性强、操作简单快捷等优势，能够进行准确无误的筛查，具有传统HPLC和低分辨LC-MS无可比拟的灵敏度，并能够在单个分析周期(12分钟)内鉴定、确证和定量分析化合物。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104597165
【申请号】CN201510062310
【发明人】谭会洁, 石峰, 郭常川, 李军, 巩丽萍
【申请人】山东省食品药品检验研究院
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年2月6日