5g/L，优选的蛋白变性剂十二 烷基磺酸钠的浓度为15mmol/L，蛋白酶K浓度为10KU/L、CaCl2浓度为llmmol/L、聚乙二醇 6000 浓度为 30g/L、TritonX-100 浓度为 5. 25ml/L、叠氮钠为 0? 75g/L;
[0033] (2)加入用HPLC法准确定值的600iimol/L糖化白蛋白样品液0? 25ml，37°C水浴 中反应390秒；
[0034] (3)向步骤⑵所得的溶液中加入浓度为200mmol/L的EDTA，2Na溶液3ml，终止 酶解反应；
[0035] (4)用HPLC法测定步骤（3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率 为 96. 3%。
[0036] 可以看出，用本实施例所述方法在酶解600iimol/L糖化白蛋白样品液390秒时酶 解效率已经达到90%以上。
[0037] 实施例3
[0038] (1)配制 12mlpH8. 5Tris-HCl缓冲液，其中Tris-HCl浓度为 200mmol/L，优选的 离子液体1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐的浓度为5g/L，优选的蛋白变性剂十二烷基 磺酸钠的浓度为25mmol/L，蛋白酶K浓度为15KU/L、CaCl2浓度为20mmol/L、聚乙二醇6000 浓度为 50g/L、TritonX-100 浓度为 10ml/L、叠氮钠为 1. 0g/L;
[0039] (2)加入用HPLC法准确定值的900iimol/L糖化白蛋白样品液0? 25ml，37°C水浴 中反应600秒；
[0040] (3)向步骤⑵所得的溶液中加入浓度为200mmol/L的EDTA，2Na溶液3ml，终止 酶解反应；
[0041] (4)用HPLC法测定步骤⑶所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率 为 94. 8%。
[0042] 可以看出，用本实施例所述方法在酶解900iimol/L糖化白蛋白样品液600秒时酶 解效率已经达到90%以上。
[0043] 实施例4
[0044] 用本发明实施例1相同的方法酶解350iimol/L的糖化白蛋白样品液，同时配制单 纯的蛋白酶解试剂作为对照组，所述单纯的蛋白酶解试剂为：12mlpH7. 5Tris-HCl缓冲液， 其中Tris-HCl浓度为20mmol/L，蛋白酶K浓度为5KU/L、CaCl2浓度为2mmol/L、叠氮钠为 0. 5g/L，对照组的操作步骤（2)?（4)同实施例1的操作步骤（2)?（4)。本发明的糖化白 蛋白酶解效率为98. 2%，对照组的糖化白蛋白酶解效率为72. 6%，以上结果显示了本发明 的有效性。
[0045] 实施例5
[0046] 用本发明实施例1步骤（1)相同的方法配制144mlpH7. 5Tris_HCl缓冲液，将此 144mlpH7. 5Tris-HCl缓冲液分成12份，置4°C保存，每个月取出1份，按实施例1所述步 骤⑵?⑷对一份300^01/1的糖化白蛋白样品液进行酶解，计算酶解率，结果见表1。
[0047]表1
【主权项】
1. 一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下： (1) 配制含有离子液体、蛋白变性剂、蛋白酶K、CaCl2、聚乙二醇6000、TritonX-100、叠 氮钠的PH7. 5-8. 5Tris-HCl缓冲液； (2) 加入用HPLC法准确定值的糖化白蛋白样品液，在35-40°C水浴中反应180-600秒； (3) 向步骤（2)所得的溶液中加入EDTA ? 2Na溶液，终止酶解反应； (4) 用HPLC法测定步骤（3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率。
2. 根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤（1)中， 所述的离子液体为1-丁基磺酸-3-甲基三氟甲磺酸盐。
3. 根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤（1)中， 所述的蛋白变性剂为十二烷基磺酸钠。
4. 根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤（1)中， 所述的PH7. 5-8. 5Tris-HCl缓冲液中Tris-HCl浓度为20-200mmol/L，含有的离子液体浓 度为0. 5-5g/L、蛋白变性剂浓度为5-25mmol/L、蛋白酶K浓度为5-15KU/L、CaCl2m度为 2-20mmol/L、聚乙二醇 6000 浓度为 10-50g/L、TritonX-100 浓度为 0? 5-10ml/L、叠氮钠为 0. 5-1. 0g/L〇
5. 根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤（2)中， 糖化白蛋白样品液的浓度CeA1为300-900 y mol/L。
6. 根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤（2)中， 反应条件为在37°C水浴中反应180-600秒。
7. 根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤（2)中， 糖化白蛋白样品液体积VeA与Tris-HCl缓冲液体积V Ms_Ha之比为VeA:VMs_Ha= 5:240。
8. 根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤（3)中， EDTA ? 2Na 溶液浓度为 200mmol/L。
9. 根据权利要求7所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤（3)中， EDTA ? 2Na的加入量乂麗.^与步骤⑵中V GA'' ^Tris-HCl的体积比为 :V GA : ^Tris-HCl : VeDTA ? 2Na - 5:240:60。
10. 根据权利要求1所述的一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其特征在于：步骤（4) 中，糖化白蛋白酶解率的计算公式为：糖化白蛋白酶解率（％ ) = {cCA1-[cCA2x (VCA+VMs_Ha +V麵.2Na)/VGA]}/CGA1X 100% ;其中CGA1是步骤⑵中糖化白蛋白样品液的浓度，c GA2是步骤 (4)中用HPLC法测定步骤（3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，VM是步骤（2)中的糖化白蛋白 样品液体积，V Ms_HC1是步骤（1)中的pH7. 5-8. 5Tris-HCl缓冲液体积，VEDTA.2Na是步骤（3) 中EDTA ? 2Na溶液的体积。
【专利摘要】本发明公开了一种快速酶解糖化白蛋白的方法，其通过以下步骤完成：1)配制含有离子液体、蛋白变性剂、蛋白酶K、CaCl2、聚乙二醇6000、TritonX-100、叠氮钠的pH7.5-8.5Tris-HCl缓冲液；2)加入用HPLC法准确定值的糖化白蛋白样品液，反应一段时间；3)向步骤(2)所得的溶液中加入EDTA·2Na溶液，终止酶解反应；4)用HPLC法测定步骤(3)所得溶液中糖化白蛋白浓度，计算糖化白蛋白酶解率。按该法进行糖化白蛋白样品的酶解，可实现在180-600秒内将300-900μmol/L的糖化白蛋白快速酶解，特别适合FAOD法测定糖化白蛋白的方法学及测定试剂开发。
【IPC分类】G01N30-02, G01N30-06
【公开号】CN104614459
【申请号】CN201510038246
【发明人】连国军
【申请人】温州医科大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月26日