一种液相色谱-串联质谱内标法测定l-羟脯氨酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及内标法测定领域，尤其是涉及一种液相色谱-串联质谱内标法测定 L-羟脯氨酸的方法。
【背景技术】
[0002] "皮革奶"是一种通过添加皮革水解蛋白从而提高蛋白质含量检测指标的牛奶。皮 革水解蛋白中含有严重超标的重金属铬等有害物质，严重危害消费者的身体健康甚至生命 安全。皮革水解蛋白也称水解胶原蛋白，而L-羟脯氨酸是水解胶原蛋白特有的氨基酸，在 乳蛋白中则没有（即水解胶原蛋白的水解产物含有L-羟脯氨酸）。因此，通过测定乳蛋白 水解样品中的L-羟脯氨酸，就可以确定掺入的水解胶原蛋白或皮革水解蛋白的量。
[0003] 低含量L-羟脯氨酸的测定，可以提高水解胶原蛋白的检出限。内标法在液相色 谱-串联质谱是一种较为准确的定量分析技术。对于乳蛋白样品的前处理较为复杂，包括 蛋白水解、样品反复加水旋蒸除盐酸等等，这时使用内标更为合适，可以校准和消除由于样 品前处理条件和检测条件波动产生的影响，获得较高的测量精度和准确度。
[0004] 液相色谱-串联质谱内标法，以L-茶氨酸为内标，检测蛋白水解物中的L-羟脯 氨酸（夏金根陈波姚守拙，高效液相色谱-质谱联用测定胶原蛋白中的羟脯氨酸，色谱， 2008, 26 (5) : 595?598 ;赵善贞，邓晓军，彭涛等，亲水性相互作用色谱-四极杆串联线性离 子阱质谱测定蛋白食品中L-羟脯氨酸残留，分析化学，2011，39 (9) : 1373?1379)。L-茶 氨酸的结构存在酰胺键（如下所示），构成蛋白的肽键本质上也是酰胺键，在酸中长时间水 解时，茶氨酸酰胺键和蛋白的肽键都同时水解。因此，酸水解使用茶氨酸为内标并不合适。 从结构的看，4-羟基-哌啶-2-羧酸为六元环，L-羟脯氨酸为五元环，而L-茶氨酸为开链 式；前二者的只有一个氨基，都是环上的亚胺结构，无酰胺，而L-茶氨酸有两个氨基，都与 L-羟脯氨酸不同。因此，结构上，4-羟基-哌啶-2-羧酸与L-羟脯氨酸相似程度远大于 L-茶氨酸。作为内标，相似程度越大，效果越好。
【主权项】
1. 一种液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS)内标法测定L-羟脯氨酸的方法，其特征在于， 该方法以4-羟基-哌啶-2-羧酸为检测内标，采用内标标准曲线法定量。
2. 根据权利要求1所述的一种液相色谱-串联质谱内标法测定L-羟脯氨酸的方法，其 特征在于，该方法具体采用以下步骤： 1) 内标的配制：选用纯度彡99. 0%的4-羟基-哌啶-2-羧酸，置于容量瓶中，加入乙 腈与水按体积比1 : 1?20配制得到的溶剂，溶解，定容，摇匀，4-羟基-哌啶-2-羧酸/ 溶剂为lg/L ; 2) 标样的配制：选用纯度> 99. 0%的L-羟脯氨酸，置于容量瓶中，加入乙腈与水按体 积比1 : 1?20配制得到的溶剂，溶解，定容，摇匀，L-羟脯氨酸/溶剂为lg/L; 3) 水解用标样准备：选用纯度> 99. 0 %的4-羟基-哌啶-2-羧酸和L-羟脯氨酸，分 别置于容量瓶中，加浓度为4?12M的盐酸，溶解，定容，摇匀，4-羟基-哌啶-2-羧酸浓度 和L-羟脯氨酸浓度都是为50mg/L ; 4) 样品准备：将待测的样品蛋白置于封管中，加入水解用标样以及浓度为4?12M的 盐酸，样品蛋白与水解用标样、盐酸的比例为：20?100mg : 1?10mL : 10?30mL，氮气 置换，密封，水解； 5) 样品前处理：步骤4)的样品在温度为90?120°C水解4?24小时，水解样品真空 蒸馏除去盐酸，pH = 5?7,置于容量瓶中，加入乙腈与水按体积比1 : 1配制得到的溶剂， 定容，摇勻，控制溶液中4-轻基-哌陡-2-羧酸/溶剂为0. 1?10mg/L ; 6) 用液相色谱-串联质谱内标法，利用内标和标样的确定含量获得L-羟脯氨酸和 4-羟基-哌啶-2-羧酸的峰面积比和标准工作曲线，然后利用上述工作曲线测定、计算样品 蛋白中L-羟脯氨酸含量。
3. 根据权利要求2所述的一种液相色谱-串联质谱内标法测定L-羟脯氨酸的方法，其 特征在于，步骤6)具体采用以下步骤： 利用步骤1)和步骤2)的内标和标样配制7个样品，样品中4-羟基-哌啶-2-羧酸/ 溶剂为100mg/L，L-羟脯氨酸/溶剂为1?200mg/L ;用液相色谱-串联质谱测定L-羟脯 氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积，以自变量（L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸 的质量比或质量浓度比），和因变量L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的面积比）数 据，计算得到工作曲线y = 10. 12x+0. 00892 (y为L-轻脯氨酸与4-轻基-哌陡-2-羧酸的 面积比，x为L-羟脯氨酸与4-羟基-哌啶-2-羧酸的质量比或质量浓度比）； 利用液相色谱_串联质谱测定前处理的样品，由保留时间确定L-羟脯氨酸和4-羟 基-哌啶-2-羧酸的面积比，通过工作曲线计算得到L-羟脯氨酸含量。
4. 根据权利要求3所述的一种液相色谱-串联质谱内标法测定L-羟脯氨酸的方法， 液相色谱条件如下：色谱柱为Venusil Hilic柱（2. 1 X 150mm，5 y m，1〇〇 A )，预处 理柱为 Venusil Hilic Venusil Hilic 柱（2.1父1〇111111，511111，丨〇〇人）；流动相六为乙腈： 0.51111]1〇1/1^乙酸铵=9:1，口11 = 6.68;流动相13为乙腈：251111]1〇1/1^乙酸铵=6:4，口11 = 6. 67 ;梯度洗脱，流速为300 y L/min ;柱温为30°C ;进样量为10 y L ; 质谱条件如下：喷雾电压为5000V ;鞘气压为172. 4kPa ;辅助气压为34. 5kPa ;毛细 管温度为275°C ;第一对扫描离子为132. 1/86. 2,碰撞能量为15eV;第二对扫描离子为 146. 1/127. 2,碰撞能量为18eV;扫描模式为单离子检测扫描（SRM)。
5. 根据权利要求4所述的一种液相色谱-串联质谱内标法测定L-羟脯氨酸的方法，液 相色谱-串联质谱测定采用美国热电公司制作的TSQQuantumAccess高效液相色谱-串 联四极杆质谱联用仪，配有喷雾电离源和大气压化学电离源。
6. 根据权利要求1或2所述的一种液相色谱-串联质谱内标法测定L-羟脯氨酸的方 法，所述的样品蛋白为乳蛋白。
7. 根据权利要求1或2所述的一种液相色谱-串联质谱内标法测定L-羟脯氨酸的方 法，所述的样品蛋白包括牛奶、羊奶、骆驼奶、人奶、豆奶或椰奶。
8. 根据权利要求1或2所述的一种液相色谱-串联质谱内标法测定L-羟脯氨酸的方 法，所述的样品蛋白为奶粉、炼乳、酸奶、奶油、奶酪、乳品饮料、蛋白粉、豆粉、奶糖、奶巧克 力或奶油巧克力。
【专利摘要】本发明涉及一种液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)内标法测定乳品中L-羟脯氨酸的方法，以4-羟基-哌啶-2-羧酸为检测内标，采用内标标准曲线法定量。现有技术相比，本发明定量限达到1mg/L，回收率80.2～116.5％，相对误差(RSD)为4.2～12.6％。本方法对样品前处理和测定的全过程，通过内标校正，有较高的测量精度和准确度。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104614452
【申请号】CN201410748715
【发明人】卢伟京, 盛立彦, 钟佳琪, 李美华, 管方方, 孙雯, 陈保华, 徐仲杰
【申请人】上海化工研究院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2014年12月9日