备的磷酸盐缓冲溶液(K2HPO4INaH2PO4= 4:1,0.15mol/L, pH 7.40)使用含10% D2O的双蒸水配制而成。其中缓冲溶液包含的TSP和NaN3(0.01%,w/v)分别用作化学位移内标物和防腐剂。
[0045]1.3 样品:
[0046]纯蜂蜜样品来自湖北省仙桃、松滋、汉川以及湖南澧县等地区的养蜂场，为保证样品的真实性，直接从蜂箱中的巢脾取样，选取自然酿造成熟的封盖蜂蜜采集。共采集24个养蜂场154个纯蜂蜜样品。蜂蜜收集后，储藏在6-8°C冰箱中备用。其中122个纯蜂蜜样品用于纯蜂蜜数据库的建立
[0047]收集到糖浆掺假蜂蜜样品共60份，其中48份用于糖浆掺假蜂蜜数据库的建立。
[0048]2.纯蜂蜜数据库的建立
[0049]2.1收集122个纯蜂蜜样品；
[0050]2.2在122个纯蜂蜜样品中称取一个纯蜂蜜样品，称取范围为40.0mg-60.0mg，其中优选称取50.0mg ；
[0051]2.3将样品置于离心管中，再加入0.6mL磷酸盐缓冲溶液，涡旋振荡10分钟至均匀混合，再离心10分钟，取上清液
[0052]2.4将步骤(2.3)中的上清液转移0.55mL到核磁共振管中，在500MHz液体核磁共振谱仪上进行1H NMR测试，实验温度为298K，利用D2O进行锁场。采用noesyprld脉冲序列(90° -^-90° -tm-90° -采样)采集一维1H NMR谱。序列中90°脉冲持续的时间为9.7微秒，h (脉冲间隔)和tm(混合时间)分别设为4.0微秒和100.0毫秒。采用预饱和方法进行水峰抑制，即施加强度50-80HZ的低功率连续波脉冲照射水峰，持续时间2.0秒。谱宽为10kHz，采样点数32768，延迟等待时间2.0秒，信号累加48次，得到样品的核磁共振信号;
[0053]2.5使用核磁共振谱仪自带的数据处理软件对样品的核磁共振信号进行傅里叶变换，变换点数为131072，指数线宽因子为1Hz，手动调相位和基线校正，2，2，3，3-氘代三甲基硅烷丙酸钠(TSP)作为内标物(共振峰设为δ 0.00)，进行化学位移定标，得到样品的1HNMR谱图；
[0054]2.6对1H NMR谱图进行分段积分，积分范围为化学位移δ 0.1- δ 6.0之间，积分间隔为δΟ.ΟΙ。为消除残余水信号的影响，将1H NMR谱中δ 4.73-4.93区域的信号剔除。共571个积分段。采用峰面积归一化，即各分段积分值除以积分区域总的峰面积，得到强度积分相对值的一组数据；
[0055]2.7在122个纯蜂蜜样品中，逐一取样品，按照步骤(2.3)?(2.6)的方法，得到122组强度积分相对值数据，每组数据一行，第I行为化学位移值，构成纯蜂蜜样品强度积分相对值的数据矩阵；
[0056]3.糖浆掺假蜂蜜数据库的建立
[0057]3.1从质检部门查获的糖浆掺假蜂蜜中收集48个样品；
[0058]3.2在48个糖浆掺假蜂蜜样品中，逐一取样品，按照步骤(2.3)?(2.6)的方法，得到48组数据，每组数据一行，第I行为化学位移值，构成糖浆掺假蜂蜜样品强度积分相对值的数据矩阵；
[0059]4.鉴别模型的构建
[0060]对122个纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵和48个糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵进行标准化，标准化方法采用自适换算(Unit Variance Scaling)。纯蜂蜜样品和糖浆掺假蜂蜜样品的类别变量值分别为I和2，阈值设定为0.5。采用偏最小二乘法将经过标准化处理的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵、糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵(X变量)与类别变量(Y变量)进行线性回归，得到鉴别模型。[0061 ] 鉴别模型中，前7个主成分对X变量以及分类Y变量的累计贡献率分别为73.8%、95.8%，其中第I成分和第2成分对Y变量的贡献率分别为76.1%、4.29% (累积贡献率为80.4% )。以成分I的得分值(t[l])和成分2的得分值(t[2])分别作为横纵坐标绘制得分散点图。如图2(纯蜂蜜样品与糖浆掺假蜂蜜样品的得分散点图)所示，纯蜂蜜样品和糖浆掺假蜂蜜样品可以在得分散点图上明显区分，即组内聚集、组间很好的分开。说明纯蜂蜜样品和糖浆掺假蜂蜜样品存在明显差异。
[0062]利用鉴别模型对170个样品(122个纯蜂蜜样品，48个糖浆掺假蜂蜜样品)的类别变量Y进行了计算。计算值在1±0.5之间的样品为纯蜂蜜样品，计算值在2±0.5之间的为糖浆掺假样品。若Y的计算值不在上述范围内，则判定样品归类不明确。图3给出了122个纯蜂蜜样品和48个糖浆掺假样品类别变量Y的计算值与实际值之间的关系。122个纯蜂蜜样品，48个糖浆掺假样品都得到了正确分类。纯蜂蜜样品类别变量Y的计算值相对集中，而掺假样品类变量Y计算值较分散。
[0063]为验证鉴别模型的可靠性，采用排列实验(Permutat1n Test)法。该方法保持X变量不变，通过随机变化Y变量的顺序，观察多个Y变量的顺序随机排列的模型与原始Y变量模型之间的差异。然后对Y变量顺序随机排列模型的R2值、Q2值与原始鉴别模型的R2值、Q2值之间做回归线。鉴别模型可靠性的验证如图4所示，共进行160次随机排列，R2回归线、Q2回归线与纵轴的截距分别为0.642、-0.115。最右端原始鉴别模型的Q 2值大于左边任何一个Y变量随机排列模型的Q2值。因此模型验证结果显示模型有效可靠。
[0064]6.鉴别蜂蜜样品
[0065]将待鉴别的44份蜂蜜样品按步骤(2.3)?(2.6)的方法进行操作，获得相应的强度积分相对值数据，导入步骤(4)中得到的鉴别模型。通过鉴别模型计算类别变量值，判断样品属于纯蜂蜜还是糖浆掺假蜂蜜。图5显示的是44份蜂蜜样品类别变量Y的计算值。计算值在1±0.5之间的样品为纯蜂蜜样品，预测值在2±0.5之间的为糖浆掺假样品。按照上述规则，32个纯蜂蜜样品，12个糖浆掺假蜂蜜样品都得到了正确分类，总体鉴别正确率为 100%。
【主权项】
1.基于氢核磁共振结合偏最小二乘法鉴别蜂蜜真假的方法，其特征在于，该方法包含下列步骤: (a)建立纯蜂蜜数据库 (al)收集N个纯蜂蜜样品，N不少于80 ； (a2)在N个纯蜂蜜样品中取一个纯蜂蜜样品一份； (a3)将样品置于离心管中，在60°C水浴至蜂蜜完全溶解，再加入样品体积8?15倍的磷酸盐缓冲溶液，涡旋振荡至均匀混合，离心，取上清液； (a4)将步骤(a3)中的上清液转移到核磁共振管中，在500MHz液体核磁共振谱仪上进行1H NMR测试，实验温度为2981(，用D2O进行锁场，采用noesyprld脉冲序列，90°脉冲宽度9.7微秒，混合时间100.0毫秒，1H NMR谱的谱宽为10kHz，采样点数32768，延迟等待时间2.0秒，累加48次，得到样品的核磁共振信号； (a5)用核磁共振谱仪自带的数据处理软件对样品的核磁共振信号进行傅里叶变换，变换点数为131072，指数线宽因子为1Hz，手动调相位和基线校正，2，2，3，3-氘代三甲基硅烷丙酸钠作为内标物，共振峰设为S 0.00，进行化学位移定标，得到样品的1H NMR谱图； (a6)对1H NMR谱图进行分段积分，积分范围为化学位移δ 0.1-δ 6.0之间，积分间隔为δ 0.01，将1H NMR谱中δ 4.73-4.93区域的信号剔除，采用峰面积归一化，得到强度积分相对值的一组数据； (a7)在N个纯蜂蜜样品中，逐一取样品，按照步骤(a3)?(a6)的方法，得到N组数据，每组数据为一行，第I行为化学位移值，构成纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵； (b)建立糖浆掺假蜂蜜数据库 (bl)从质检部门查获的糖浆掺假蜂蜜中收集M个样品，M不少于40 ； (b2)在M个糖浆掺假蜂蜜样品中，逐一取样品，按照步骤(a3)?(a6)的方法，得到M组数据，每组数据为一行，第I行为化学位移值，构成糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵； (c)构建鉴别模型 对纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵和糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵进行标准化，标准化方法采用自适换算；类别变量Y代表样品的类型，数值为“1”，代表纯蜂蜜样品，数值为“2”，代表糖浆掺假蜂蜜样品，阈值设为0.5 ;采用偏最小二乘法将经过标准化处理的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵、糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵与类别变量Y进行线性回归，得到鉴别模型； (d)鉴别模型的可靠性检验 采用排列实验法对鉴别模型的可靠性进行检验:通过η次随机改变类别变量的排列顺序，得到相应不同的累积贡献率值R2、预测能力值Q2，n多100 ;然后对类别变量顺序随机排列模型的R2值、Q 2值与类别变量顺序未改变模型的R2值、Q 2值之间做回归线，如果类别变量顺序未改变模型的Q2值大于任何一个类别变量随机排列模型的Q2值，说明鉴别模型可靠有效，可以使用； (e)蜂蜜样品的鉴别 将待鉴别蜂蜜样品按步骤(a3)?(a6)的方法，得到强度积分相对值的一组数据；将其导入步骤(c)中的鉴别模型，得到类别变量Y的数值，当类别变量Y在1±0.5之间时，待鉴别蜂蜜样品为纯蜂蜜，当类别变量Y在2±0.5之间时，待鉴别蜂蜜样品为糖浆掺假蜂蜜； (f)数据库的扩充 如果待鉴别蜂蜜样品的鉴别结果为纯蜂蜜，在步骤(a7)的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵中增加一行该待鉴别蜂蜜样品的强度积分相对值的一组数据，得到新的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵，并用该矩阵更新原步骤(a7)的纯蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵； 如果待鉴别蜂蜜样品的鉴别结果为糖浆掺假蜂蜜，在步骤(b2)的糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵中增加一行该待鉴别蜂蜜样品的强度积分相对值的一组数据，得到新的糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵，并用该矩阵更新原步骤(b2)的糖浆掺假蜂蜜样品的强度积分相对值数据矩阵。
【专利摘要】本发明公开了一种基于氢核磁共振结合偏最小二乘法鉴别蜂蜜真假的方法。该方法涉及食品检测，是氢核磁共振指纹图谱在食品检测的应用。该方法首先分别建立纯蜂蜜数据库和糖浆掺假蜂蜜数据库，然后构建鉴别模型，对鉴别模型进行可靠性检验，再对待测蜂蜜样品的进行鉴别，并将待测蜂蜜样品的鉴别结果对数据库的进行扩充，以增加样品的代表性和判别能力。优点是：技术可靠，操作简单，可在短时间内处理大量样品，快速筛查出可疑蜂蜜样品，避免了主观因素、人为误差，结论科学可靠。
【IPC分类】G01N24-08
【公开号】CN104713895
【申请号】CN201510111292
【发明人】陈雷, 刘红兵, 罗立廷
【申请人】中国科学院武汉物理与数学研究所
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月13日