[0041] 本发明的"测试分子"测定方面可进一步包括检测测试分子的原位活性的步骤。例 如，在梭菌神经毒素或TSI的情形中，测定可进一步包括检测SNARE蛋白切割的步骤。可采 用任何该类检测手段，例如W095/33850中所述的方法或通过FRET测定。
[0042] 本发明的测定可单独分开采用W评价阻断分子对真核细胞的内体运输系统的抑 制效应。由此，在相关方面，本发明提供一种测定，其包括：
[0043] i)使真核细胞与结合所述真核细胞表面上存在的结合位点的对照分子接触，其中 所述对照分子与结合位点形成结合复合物，通过内吞进入真核细胞，在此期间形成含有对 照分子的内体，并且其中所述对照分子通过穿越内体的内体膜进入所述真核细胞的胞质；
[0044] ii)使对照分子与所述真核细胞温育，并由此允许
[0045] a)对照分子与存在于真核细胞上的结合位点结合并形成结合复合物，从而允许所 述结合复合物通过内吞进入真核细胞；
[0046] b) -个或多个内体在所述细胞之内形成，其中所述一个或多个内体含有对照分 子；和
[0047] C)所述对照分子通过穿越所述一个或多个内体的内体膜进入所述真核细胞的胞 质；
[0048] iii)使真核细胞与有待评价其遏制从一个或多个内体释放对照分子的能力的测 试抑制剂分子接触。所述真核细胞与测试抑制剂分子的接触可W在步骤i)之前、期间或之 后和/或步骤ii)期间或之后进行；
[0049] iv)在预定时间段后，检测存在于所述一个或多个内体中的对照分子的量，或者检 测存在于所述真核细胞的胞质中的对照分子的量；
[0050] V)将步骤iv)中检测到的对照分子的量与对照值相比较，其中所述对照值代表在 步骤iii)之前存在于所述一个或多个内体中的对照分子的量或存在于胞质中的对照分子 的量；
[0化1]Vi)通过确定存在于所述一个或多个内体之中的对照分子的量的相对变化，或者 通过确定存在于所述真核细胞胞质中的对照分子的量的相对变化，对测试抑制剂分子赋予 抑制值。
[0化引对照分子可W是上述的"小分子"治疗剂，诸如PMSA抑制剂（参见Liuet al.，2008)或芬戈莫德，莫那匹尔，氨哲二磯酸二钢，甲氨蝶岭，了螺环酬，奈莫必 利，apipipiprazole，联苯芦诺，SKF82958,奥曲肤，MK-5046,F038-WE-05,利美巧定， SC册55842,salvinorin，CP55940 或纳米颗粒。
[0053] 或者，对照分子可W是较大分子如多肤或蛋白质。特定实例包括毒素如细胞毒性 蛋白质和非细胞毒性蛋白质。在该方面，提及多肤和蛋白质包括天然存在的和重组制备的 多肤和蛋白质。合适的细胞毒性和非细胞毒性蛋白质的实例在此之前已描述过。有关非 细胞毒性蛋白质，优选的实例包括梭菌神经毒素（如破伤风毒素，BoNT/A，BoNT/B，BoNT/ C-i，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F，BoNT/G，了酸梭菌杞butyricum)，包括其天然和修饰形式， W及其组合），TSI(如在此之前所述的那些），antarease蛋白酶和IgA蛋白酶。
[0化4] 测试抑制剂分子的实例包括孔道阻断剂如川棟素-参见Fischer,A.et al. (2009)PNAS，V〇1. 106，N〇. 5，pp. 1330-1335 ;质子-ATP酶阻断剂如己佛洛霉素A-参见 Bartzetal. (2011)BiochemJ435pp. 475-487,伴刀豆球蛋白A灯schemeetal.但00巧 JVirol，Vol.80，No. 4，pp. 12：M-1741)和灵杆菌素-参见Ohkumaetal. (1998)JBiochem Vol. 3：M，pp. 731-741。
[0化5] 如上所述设及本发明基础测定的所有步骤同样适用于上述测试抑制剂分子测定。
[0056] 上述测试抑制剂分子测定中的接触步骤iii)可进行任意给定时间段，例如在开 始温育步骤ii)之前5分钟到5天的时间段，如在开始温育步骤ii)后30分钟到12小时 之间，或者30分钟到10小时之间，或者30分钟到8小时之间，或者1-8小时之间。或者， 步骤iii)可进行与步骤ii)相同长度的时间，或者其开始可延迟5分钟到5天，如1-12小 时或2-10小时或4-8小时或6-8小时。典型地，一旦达到"稳态"（经由步骤ii))后进行 接触步骤iii)，在所述稳态中对照分子W大致相同的速率进入和离开胞内的内体。
[0057] 本发明的抑制剂方面还可包括除去过量的对照分子和/或测试抑制剂分子的步 骤。所述"去除步骤"在抑制剂方面测定上下文中指定为"步骤iiia)"。在本发明"测试分 子"测定方面上下文中所有上述"去除步骤iii)"的实施方案同样适用于本发明"抑制剂分 子"测定方面的"去除步骤iiia)"。
[0化引 附图列表 [0化9] 图1
[0060] 内吞相关的关键步骤。4个关键步骤柄;为1-4。
[0061] 图 2
[0062] 祀向于表达GHRHR的GH3细胞的TSI的内化。图2A;细胞在不存在TSI条件下温 育。图2B;细胞在3yM含GHRH祀向部分的TSI存在下温育60分钟。
[0063] 图 3
[0064] 祀向于表达GHRHR的GH3细胞的TSI的浓度依赖性内化。
[00(55]图 4
[0066] 祀向于大鼠垂体细胞的TSI的内化。图4A;细胞在不存在TSI条件下温育。图4B; 细胞在1yM含GHRH祀向部分的TSI存在下温育60分钟。
[0067] 图 5
[0068] 含GHRH祀向部分的TSI浓度依赖性内化到大鼠垂体细胞中。细胞与W下物质温 育60分钟；（?）具有GHRH祀向部分的TSI;(0)相应的未配体化TSI。
[0069] 图 6
[0070] 祀向于表达大鼠GHR皿的G册细胞的TSI的内化和内体逃逸。将连续处理方案与 脉冲追踪处理方式作比较。
[0071] 图 7
[007引祀向于HT-1080细胞的TSI的内化。图7A;细胞在不存在TSI条件下温育；图7B; 细胞在2yM含EGFR祀向部分的TSI存在下温育60分钟。
[0073] 图 8
[0074] 祀向于表达GHRHR的CH0-K1细胞的TSI的浓度依赖性内化。 实施例
[0075] 实施例1
[0076] 将A549细胞接种到96孔板中并培养2天W达到~90 %汇合。将 Alexa-fluor?488标记的表皮生长因子巧G巧与细胞温育60分钟。洗细胞，增加温育 时间后，使用高内涵筛选测定总细胞巧光，内体斑点计数和内体巧光。
[0077] 实施例2
[0078] 将表达大鼠生长激素-释放激素（GHRH)受体的G册细胞接种到多聚D赖氨酸包 被的96孔板中。24小时后，将包含GHRH祀向结构域（1-44)W及血清型C肉毒杆菌神经 毒素的易位和轻链结构域的TSI与细胞温育30分钟。洗细胞，在增加温育时间通过酸洗除 去与细胞表面结合的TSI。将细胞用多聚甲醒固定并用洋地黄皂巧透化。肉毒杆菌神经毒 素c的TSI轻链用兔抗LC肉毒杆菌神经毒素c一抗和山羊抗兔AIexa-干Iuor?488标 记二抗来检测。使用高内涵筛选监测内体内的积聚和内体逃逸。
[0079] 实施例3
[0080] 制备胚胎脊髓神经元并培养在基质胶包被的96孔板中。将肉毒杆菌神经毒素A 与神经元温育10分钟，然后洗细胞。在增加温育时间后用皂巧透化细胞，并用抗肉毒杆菌 神经毒素A的LC的抗体检测肉毒杆菌神经毒素的LC。使用高内涵筛选监测内体内的积聚 和内体逃逸。
[0081] 实施例4
[0082] 将表达人甲状旁腺激素受体prai的肥K293细胞接种到多聚D赖氨酸包被的96孔 板中。过夜温育后，将细胞与myc标记的PTH(l-34)温育45分钟。洗细胞，增加温育时间 后，将细胞固定并用吐温20透化。用若丹明标记的抗myC抗体检测myC-标记的PTH(1-34)。 使用高内涵筛选监测内体内的积聚和内体逃逸。
[0083] 实施例5
[0084] 将表达血管活性肠肤1受体的CHO-K1细胞接种到96孔板中并温育过夜。将细胞 单独或与增加浓度的内体逃逸抑制剂温育60分钟，然后将生物素化TSI与细胞共温育20 分钟。清洗除去TSI，在增加温育时间后使用多聚甲醒固定细胞。将细胞用洋地黄皂巧透化 并生物素化。使用链霉抗生物素和Alexa-fluor⑥488标记的抗链霉抗生物素抗体检 测TSI。通过高