具有增强的光学信号的微流体传感器的制造方法
【专利说明】具有增强的光学信号的微流体传感器
[0001] 交叉引用
[0002] 本申请要求2012年10月1日提交的序列号为61/708, 314的美国临时申请的权 益，通过本文中的提述收录该申请用于所有目的。
[0003] 关于得到联邦政府资助的研宄的声明
[0004] 本发明是在美国政府的支持下由（美国）国防部高级研宄计划局（DARPA)授予的 基金号FA9550-08-1-0222资助而做出的。美国政府对本发明具有某些权利。
[0005] 发明背景
[0006] 人们对于增强发光信号（例如荧光信号）和检测灵敏度及缩短生物学和化学测定 法的测试时间存在强烈的需求。本申请涉及用于实现性能增强（即冷发光放大和检测灵敏 度改进）和测定时间缩短的微结构/纳米结构和分子层和微流体通道和方法，它们的制造 和应用。
[0007]发明概述
[0008] 本公开提供，除其他事项之外，用于检测液体中的分析物的微流体装置，其包括： 基片；所述基片的表面上的流体通道；和位于所述通道的某一位置的纳米传感器，该纳米 传感器包括：纳米结构，该纳米结构包括至少一个纳米结构元件，每个元件包括至少两个由 间隙分开的金属结构；和沉积于该纳米结构的表面上的捕捉剂，其中该捕捉剂特异性结合 分析物。当分析物结合于或接近于捕捉剂时，该纳米传感器放大去往和/或来自分析物或 附接于分析物的光标记物的光信号。本公开还提供能与移动智能电话集成的便携式测定系 统。微流体装置还提供比没有微流体通道的装置更短的测定时间和更小的样品体积。
[0009] 附图简述
[0010] 本领域技术人员将会理解，如下所述的附图仅用于说明目的。所述附图并不意图 以任何方式限制本文教导的范围。有些附图并未依比例给出。
[0011] 图1A-1I示意性地示出了纳米流体装置的一些实施方案的各种特征。
[0012] 图2示意性地示出了一种示例性的抗体检测测定。
[0013] 图3示意性地示出了一种示例性的核酸检测测定。
[0014] 图4示意性地示出了另一实施方案的核酸检测测定。
[0015] 图5示意性地示出了一种示例性的自组装单层。
[0016] 图6不意性地不出系统的一个实施方案。
[0017] 图7示意性地示出了系统的另一实施方案。
[0018] 图8示意性示出智能手机的实施方案。
[0019] 图9:装置结构及其制造过程。（a-b)装置架构；（c)通过纳米压印制造的铬（Cr) 点阵列的电子扫描显微镜（SEM)图像；（d-e)底部传感器和通道层的制造；（f)中间的聚二 甲基硅氧烷（PDMS)入口和出口层；（g)金（Au)蒸镀和全部三个层的接合。
[0020] 图10 : (a)模型免疫测定实验的光学机构。激光束扫描面积为100 ymX 100 ym ; (b)-(c)荧光强度与浓度的关系。五参数逻辑回归模型显示，微流体通道装置中的D2PA的 检测极限为850aM;玻璃参比的检测极限为2nM，96孔板测定中的D2PA的检测极限为lfM。
[0021] 图11A和11B :流体通道中的金纳米点的纳米压印形成图案的原理图。（a)涂覆有 底层的二氧化硅（Si02)/抗反射膜（ARC)的熔融石英基片；(b)通过光刻定义出的微流体通 道；（c)在底层的二氧化娃/抗反射膜和恪融石英中图案化（patterning)的微通道，在这 里光刻胶被除去；（d)涂覆在基片上的二氧化硅/抗反射膜的中间层；(e)第二次光刻，以 定义出用于金纳米点的纳米结构窗口（nano-featuring patterning window) ;(f)通过反 应离子刻蚀（RIE)转印到中间层二氧化硅/抗反射膜的纳米结构窗口； (g)基片上涂覆并 平坦化的压印胶层；(h)通过纳米柱压印模具在压印胶中图案化覆盖以铬掩模的纳米孔； (i)通过蒸镀和剥离纳米柱在流体通道中图案化金纳米点。
[0022] 图12A :DNA分子的荧光增强。（a)等离激元（Plasmonic)纳米结构增强荧光以实 现增强荧光激发和辐射发射的示意图；(b)流体通道中的等离激元D2PA结构同时拉伸DNA 和增强荧光的原理图，其中圆点指示出强荧光增强的热点。
[0023] 图12B:图案化流体通道中的等离激元金D2PA的原理图。a-b，通道中的D2PA阵 列的设计横截面几何尺寸：（a)密封之前；(b)为增强DNA荧光而接合之后。c-j，制造示意 图：（c)涂覆有二氧化硅/抗反射膜底层的熔融石英基片；（d)熔融石英中定义的微流体通 道；（e)二氧化硅/抗反射膜的中间层；（f)第二次光刻和反应离子刻蚀，以在二氧化硅（中 间叠层）中定义出D2PA结构窗口；（g)压印胶中UV压印出的纳米孔；(h)剥离后熔融石英 上图案化的Cr纳米点；（i)熔融石英中的纳米柱蚀刻；（j)蒸镀金之后的D2PA阵列。
[0024] 图12C:流体通道中制造的纳米柱和D2PA纳米结构。a至b，在流体通道中选择 性地图案化并且与通道边缘自对齐的纳米柱的侧视（45° )SEM图像，纳米柱的尺寸为高 60nm、直径115nm。（c)连接到入口 /出口及附属通道的通道中的纳米柱区域的光学图像。 d-e，制造的D2PA阵列的SEM图像：（d)具有10nm的垂直腔间隙、直径为145nm的D2PA阵 列的高倍率45°侧视图，剖视图作为嵌入图显示；和（e)低倍率顶视图，显示出大面积均匀 的纳米结构（patterning)。（f)金沉积之后流体通道中的D2PA阵列的光学图像。
[0025] 相应的附图标记在附图的全部若干图面中均指示相应的部件。应当理解的是，附 图用于示出本公开中给出的构思，并且不是依比例给出的。
[0026] 在详细解释本发明的任何实施方案之前应当理解的是，本发明的应用不限于下文 描述中陈述的或附图中图示的构造细节和部件布置。
[0027] 定义
[0028] 在更详细地描述例示性实施方案之前，列出下述定义，以说明并界定说明书中使 用的术语的含义和范围。
[0029] 术语"分子粘附层"或"粘附/间隔层"指具有确定厚度的一层或多层分子，其包 括附接于纳米传感器的内表面和能结合至捕捉剂的外表面。它还控制从金属至发光分子或 材料的距离。
[0030] 术语"捕捉剂反应性基团"指分子中具有化学功能的部分，其对捕捉剂具有反应 性，即，能与捕捉剂中的部分（例如羟基、硫氢基、羧基或胺基团）反应生成稳定的强（例如 共价）键。
[0031] 如本文中使用的，术语"捕捉剂"指经由相互作用结合靶分析物的药剂，该相互作 用足以允许该药剂结合该靶分子并从不同分子的异质混合物中浓缩该靶分子。结合相互作 用通常由捕捉剂的亲和力区介导。典型的捕捉剂包括任何能特异性结合靶分析物的部分。 某些捕捉剂以小于约1(T6M(例如小于约1(T7M、小于约1(T 8M、小于约1(T9M、小于约lO^M、小 于约l(TnM、小于约1(T12M、至低达1(T16M)的解离常数（K D)特异性结合靶分子，而与其它分子 没有显著结合。例示性捕捉剂包括但不限于蛋白质（例如抗体）和核酸（例如寡核苷酸、 DNA、RNA，包括适体）。
[0032] 术语"特异性结合"和"选择性结合"指捕捉剂优先结合存在于不同靶分子的异质 混合物中的特定靶分子的能力。特异性或选择性结合相互作用会区分样品中想要的（例如 有活性的）和不想要的（例如无活性的）靶分子，通常大于约10至1〇〇倍或更多（例如大 于约1000或10, 000倍）。
[0033] 术语"蛋白质"指任何长度的氨基酸聚合物形式，即大于2个氨基酸、大于约5个 氨基酸、大于约10个氨基酸、大于约20个氨基酸、大于约50个氨基酸、大于约100个氨基 酸、大于约200个氨基酸、大于约500个氨基酸、大于约1000个氨基酸、大于约2000个氨基 酸，通常不大于约10, 〇〇〇个氨基酸，可以包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修 饰或衍生化的氨基酸，和具有经过修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限 于：具有异源氨基酸序列的融合蛋白；具有异源或同源前导序列、带有或不带有N端甲硫氨 酸残基的融合物；带免疫学标签的蛋白质；具有可检测的融合配偶的融合蛋白，例如包含 荧光蛋白、半乳糖苷酶、萤光素酶等作为融合配偶的融合蛋白；等等。这些术语还包括 在细胞中经过翻译后修饰（例如糖基化、切割、分泌、异戊二烯化、羧基化、磷酸化、等）的多 肽，具有二级或三级结构的多肽，和与其它部分（例如其它多肽、原子、辅因子等）强结合 (例如共价或非共价）的多肽。
[0034]术语"抗体"意图指免疫球蛋白或其任何片段，包括能够结合抗原的单链抗体和噬 菌体展示抗体。
[0035] 术语"核酸"和"多核苷酸"在本文中可互换使用，描述由核苷酸（例如脱氧核糖核 苷酸或核糖核苷酸）构成的任何长度的聚合物，或合成生成的、能够与天然存在的核酸以 类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式杂交（例如能参与Watson-Crick碱基配对 相互作用）的化合物（例如美国专利No. 5, 948, 902及其引用的参考文献中记载的PNA)。
[0036] 如本文中使用的，术语"互补"指核苷酸序列通过氢键与感兴趣的靶核酸碱基配 对。在规范的Watson-Crick碱基配对中，在DNA中，腺嘌呤（A)与胸腺嘧啶（T)形成碱基 对，鸟嘌呤（G)与胞嘧啶（C)形成碱基对。在RNA中，胸腺嘧啶被尿嘧啶（U)替换。如此，A 与T互补，而G与C互补。通常，"互补"指核苷酸序列与感兴趣的靶完全互补，使得序列中 的每一个核苷酸与靶核酸中对应的位置上的每一个核苷酸互补。当核苷酸序列与非靶序列 不是完全互补（100%互补性），但由于核苷酸序列的某些区段与非靶序列的互补性而仍然 可以与非靶序列进行碱基配对时，可以计算百分比互补性以评估非特异性（脱靶）结合的 可能性。一般而言，50%或更低的互补性不引起非特异性结合。另外，70%或更低的互补性 在严格杂交条件下可能不引起非特异性结合。
[0037] 如本文中使用的，术语"核糖核酸"和"RNA"表示由核糖核苷酸构成的聚合物。
[0038] 如本文中使用的，术语"脱氧核糖核酸"和"DNA"表示由脱氧核糖核苷酸构成的聚 合物。
[0039] 如本文中使用的，术语"寡核苷酸"表示长约10个至200个核苷酸，直至300个核 苷酸或更长，例如长至500nt或更长的单链核苷酸多聚体。寡核苷酸可以是合成的，而且在 某些实施方案中，长度小于300个核苷酸。
[0040] 如本文中使用的，术语"附接"指一个分子与另一个分子的强（例如共价或非共 价）键连接。
[0041] 如本文中使用的，术语"表面附接"指分子强附接于表面。
[0042] 如本文中使用的，术语"样品"涉及含有一种或多种感兴趣的分析物的材料或材料 混合物。在特定实施方案中，样品可以是自生物学样品获得的，生物学样品例如细胞、组织、 体液、和大便。感兴趣的体液包括但不限于羊水、房水、玻璃状液、血（例如全血、成分血、血 浆、血清、等）、母乳、脑脊液（CSF)、耵聍（耳垢）、乳糜、食糜（chime)、内淋巴、外淋巴、粪、 胃酸、胃液、淋巴、粘液（包括鼻涕（nasal drainage)和体内痰（phlegm))、心包液、腹膜液、 胸膜液、脓、稀粘液（rheum)、唾液、皮脂（皮肤油）、精液、咳出痰（sputum)、汗、滑液、泪、呕 吐物、尿和呼气冷凝液。在特定实施方案中，样品可以是自受试者（例如人）获得的，而且 可以在用于主题测定法之前进行加工。例如，在分析之前，可以在使用之前自组织样品提取 蛋白质/核酸，提取方法是已知的。在特定实施方案中，样品可以是临床样品，例如自患者 收集的样品。
[0043]术语"分析物"指能被捕捉剂结合和检测的分子（例如蛋白质、核酸、聚合物或其 它分子、它们的复合物或颗粒）。
[0044]术语"测定"指测试样品以检测分析物的存在和/或丰度。
[0045]如本文中使用的，术语"确定"、"测量"、"评估"和"测定"可互换使用，包括定量和 定性测定二者。
[0046] 如本文中使用的，术语"发光标记物"指当处于外部激发下时能发出光的标记物。 这可以是冷发光（luminescence)。焚光标记物（其包括染料分子或量子点）和冷发光标记 物（例如电致发光或化学发光标记物）是发光标记物的类型。外部激发对于荧光而言是光 (光子）、对于电致发光而言是电流，对于化学发光而言是化学反应。外部激发可以是上述 的组合。
[0047] 短语"带标记的分析物"指这样的分析物，该分析物被发光标记物可检测地标记， 使得该分析物能够通过评估该标记物的存在来加以检测。带标记的分析物可以是被直接标 记的（即，可以将分析物自身直接缀合于标记物，例如通过强的键，如共价或非共价键直接 缀合于标记物），或者，带标记的分析物可以是被间接标记的（即，分析物被次级捕捉剂所 结合，而次级捕捉剂是被直接标记的）。
[0048] 术语"杂交"指核酸与互补核酸经Watson-Crick碱基配对的特异性结合。因而， 术语"原位杂交"指核酸与中期或间期染色体的特异性结合。
[0049]就核酸而言，术语"杂交"和"结合"可互换使用。
[0050]术语"捕捉剂/分析物复合物"是捕捉剂与分析物的特异性结合所导致的复合物。 捕捉剂和该捕捉剂所针对的分析物通常会在"特异性结合条件"或"适合于特异性结合的条 件"下彼此特异性结合，其中此类条件为那些容许捕捉剂和溶液中要结合的分析物之间发 生结合的条件（在盐浓度、PH、洗涤剂、蛋白质浓度、温度等方面）。此类条件（特别是就抗 体及其抗原和核酸杂交而言）是本领域公知的（参见例如Harlow and Lane(Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) 和Ausubel，et al, Short Protocols in Molecular Biology, 5th ed.，Wiley&Sons, 2002) 〇
[0051] 如本文中使用的，术语"特异性结合条件"指生成包含彼此特异性结合的成对分子 的核酸双链体或蛋白质/蛋白质（例如抗体/抗原）复合物，同时不利于并非彼此特异性 结合的分子之间形成复合物的条件。特异性结合条件是杂交和清洗条件二者的总和或组合 (全体），而且在必要时可以包括清洗和封闭步骤。
[0052] 对于核酸杂交，特异性结合条件可以如下实现：于42°C在50%甲酰胺、5x 55〇（150禮似(：1，151111柠檬酸三钠）、5〇1111磷酸钠（?117.6)、51〇6111^『肚氏溶液、10%硫酸 右旋糖酐、和20 y g/ml经变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中温育，接着于约65°C在0. lx SSC 中清洗滤膜。
[0053] 对于抗体结合抗原，特异性结合条件可以如下实现：在封闭溶液（例如含3% BSA 或脱脂奶的PBS)中封闭含有抗体的基片，接着与在封闭缓冲液中稀释的含有分析物的样 品一起温育。在该温育之后，在清洗溶液（例如PBS+TWEEN 20)中清洗基片并与捕捉第二 抗体（检测抗体，它识别抗原中的另一位点）一起温育。捕捉第二抗体可以缀合有光学可 检测标记物，例如荧光团，诸如IRDye800CW、Alexa 790、Dylight 800。再次清洗之后，可以 检测结合的捕捉第二抗体的存在。本领域技术人员会知道可加以修改以提高检测到的信号 及降低背景噪声的参数。
[0054] 术语"次级捕捉剂"（也可称作"检测剂"）指对抗原具有高度特异性亲和力的一 组生物分子或化合物。次级捕捉剂可以与光学可检测标记物，例如酶、荧光标记物等强连 接，或者次级捕捉剂自身可以被另一通过生物缀合而连接有光学可检测标记物的检测剂所 检测（Hermanson, "Bioconjugate Techniques"Academic Press, 2nd Ed. ,2008)。
[0055] 术语"生物素部分"指包含生物素或生物素类似物如脱硫生物素、氧代生物素、 2' _亚氨基生物素、二氨基生物素、生物素亚砜、生物胞素等的亲和剂。生物素部分以至 少1(T8M的亲和力结合链霉亲合素。生物素亲和剂还可以包含接头，例如一 LC-生物素、 一LC-LC-生物素、一SLC-生物素或一 PEGn-生物素，其中n为3-12。
[0056] 术语"链霉亲合素"指链霉亲合素和亲合素二者，以及它们的任何以高亲和力结合 生物素的变体。
[0057] 术语"标志物"指这样的分析物，它在生物学样品中的存在或丰度与某种疾病或状 况相关。
[0058] 术语"键"包括共价和非共价键，包括氢键、离子键和由范德华力生成的键。
[0059] 术语"放大"指信号的量级（magnitude)的增大，例如信号增大至少10倍、增大至 少100倍、、增大至少1，000倍、增大至少10, 000倍、或增大至少100, 000倍。