基于hplc-hg-afs系统的砷元素形态分析仪器参数优化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种元素有机形态的分析测试技术，特别是涉及砷元素形态分析方 法。
【背景技术】
[0002] 对各种元素的不同化合物进行化学形态学分析，对于了解环境、地质以及生物样 品中元素的毒性，代谢和输运性能是非常重要的，因此，近年来形态分析越来越成为一个活 跃的研宄领域。砷是人体的必需元素，并且是许多环境、生物样品中化合物的基础构成元 素，但是对于不同形态的砷化物，其毒性却相差很大。一般情况下，无机砷化合物的毒性要 大于有机砷化合物。不同价态的砷化物砷化物其毒性也不同，例如，据报道，亚砷酸易溶于 水，其毒性要远大于一般的砷化物。
[0003] 一般来说，砷化物的毒性符合下列顺序（最高到最低毒性）：胂〉无机亚砷酸 盐〉有机三价砷化合物（arsenooxides) >无机砷〉有机五价砷化物〉胂化合物〉元素砷 [89-91]。砷甜菜碱和砷胆碱被认为是无毒的。一般来说，砷的毒性通常是与浓度相关的， 在相关标准规定的剂量下，不会影响动物或者人体的健康。但是由于砷的遗传毒性和致癌 性，国际癌症研宄机构（IARC)机构将其列为重大风险元素，据报道，全球有多达60-100万 人在长期暴露于过量砷的风险环境中。
[0004] 部分有机砷也是兽药经常使用的添加剂，例如，阿散酸（学名对-氨基苯胂酸， 4-Aminobenzenearsonic acid，ASA)、硝苯月申酸（4-nitrophenylarsonic acid，NIT)、洛克 沙砷（4-hydroxy-3_nitrophenylarsonic acid，R0X)作为兽药，能够防治球虫肠道寄生虫， 所以被禽畜养殖业广泛使用[92]。阿散酸和洛克沙砷用于防治家禽类球虫寄生虫和家畜 类出血性肠炎，硝苯胂酸作为兽药用于防治由原生组织滴虫导致的组织滴虫病（黑死病）。 作为饲料添加剂，这些有机砷制剂的使用会导致砷元素在动物体内的积累，每年家畜的排 泄物用于农业肥料，尤其是水稻种植，会导致土壤中砷含量过高，植物吸收了土壤中的砷元 素，就会进入人类食物链，有报道质疑这些有机砷制剂的实际效果，并指出这些有机砷制剂 会在人类体内造成累积。此外，很多报道指出，如果此类有机砷制剂超标使用，一些因素会 造成其分解为严禁使用的有毒砷化物。更糟的是，有报道称R0X会最终分解为溶于水的剧 毒性的无极砷。
[0005] 为了保证动物源性食品安全，避免此类有机砷制剂的滥用，有必要对动物组织内 砷形态进行严格检测，以及对于动物源性食品中有机砷化物的有效的提取和检测方法。
【发明内容】
[0006] 为了克服上述现有技术，本发明提出了一种砷元素形态分析仪器参数优化方法， 实现了 HPLC-HG-AFS方法用于有机砷形态分析方法的仪器参数优化，最终在优化的条件下 检测了三种有机砷制剂的标准曲线，对该方法进行了验证。
[0007] 应用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱仪对阿散酸、肖苯胂酸和洛克沙 胂等三种形态砷化物进行分离检测的方法，并对仪器各项条件进行优化。
[0008] 本发明提出了一种基于HPLC-HG-AFS系统的砷元素形态分析仪器参数优化方法， 该方法包括以下步骤：
[0009] 采用5%甲醇水溶液（含0? 1% (v/v)三氟乙酸，0? 05mol L-1磷酸二氢钾）作为 流动相，在流动相中加入三氟乙酸（TFA)调整pH值，加入腿#04作缓冲盐，实进行高效液相 色谱分离条件的优化；
[0010] 进行氢化物发生条件优化，具体包括：
[0011] 选择盐酸和耶氏蠕动泵转速均为120r mirT1，进行蠕动泵流速优化、在盐酸浓度为 5% (v/v)的条件下，还原剂KBH4的浓度选为20g L'进行还原剂浓度优化、在还原剂采用 含5g PKOH的20g L_iKBH4溶液的条件下，盐酸的浓度选为5%，进行盐酸浓度优化；
[0012] 进行原子荧光检测器参数优化，具体包括：
[0013] 选定330V为归一化标准值，进行光电倍增管高压；采用100mA空心阴极灯电流，进 行空心阴极灯电流优化；选定300mL mirT1为载气流速的最优值，进行载气流速优化；选择 最小的屏蔽气流量，达到最佳的屏蔽作用，进行屏蔽气流速优化
[0014] 在上述优化的条件下，分别选取0. 1~2ug ml/1阿散酸、洛克沙胂和肖苯砷酸三种 形态砷化物混标计算HPLC-HG-AFS系统的标准曲线。
[0015] 与现有技术相比，本发明在优化的条件下，该方法重复性好，准确度高。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明的实验系统结构示意图；
[0017] 图2为在TFA/甲醇体积比分别为95:5、90:10、80:20三种不同的条件下所得到谱 图；
[0018] (a)、采用不同比例TFA/甲醇作为流动相的砷形态检测谱图；其中检测样品采用 1. Oug mL-1 砷混标；（l)ASA ; (2)NIT ; (3)R0X.;
[0019] (b)、不同流动相中三种砷化物的相对信号强度：
[0020] 流动相A:95:5 v/v TFA/methanol pH = 2. 43 ;流动相B:90:10 v/v TFA/methanol pH = 2. 52 ;流动相 C:80:20 v/v TFA/methanol pH = 2. 72,其他参数见表 2 ;
[0021] 图3为还原剂流速对于实验结果的影响示意图；
[0022] 图4为KBH4浓度优化实验的原子荧光检测结果，横坐标为KBH 4浓度，纵坐标为谱 峰面积；采用5% (v/v)盐酸，重复检测三次；
[0023] 图5为盐酸浓度优化实验的原子荧光检测结果，横坐标为盐酸浓度，纵坐标为谱 峰面积。采用含5% K0H的20% KBH4溶液，重复检测三次；
[0024] 图6为不同光电倍增管负高压下信号的信噪比示意图；
[0025] 图7为不同空心阴极灯电流条件下检测信号的信噪比示意图；
[0026] 图8为载气流速对于检测结果的影响示意图；
[0027] 图9为屏蔽气对于检测结果的影响；
[0028] 图10浓度范围0. 1~2ug ml/1的砷标准溶液检测标准谱图；检测条件如表2 ;
[0029] 图11浓度范围0. 1~2ug ml/1的砷标准溶液检测标准曲线图；检测条件见表2。 标准方程与相关系数见表3 ; % RSD，n = 3。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明，但本发明的实施范围并不 局限于此。
[0031] 一、本发明所使用的实验仪器与试剂
[0032] 1、实验仪器
[0033] 实验所用的仪器主要有：AFS9600无色散氢化物发生-原子荧光光谱仪（HG-AFS) (北京海光仪器有限公司）、HPLC P600高效液相色谱泵（美国Labtech公司），配备 7725i 六通路进样阀（美国 Rheodyne, Cotati 公司），Phenomenon C18 色谱柱（Luna5u， 250X4. 60mm)。HPLC-UV-HG-AFS 系统结构图如图 1-2 所示。
[0034] 2、实验试剂
[0035] 实验中用到的所有试剂均为分析纯。实验用到的试剂：NaOH(天津风船化学试剂 有限公司）、KBH 4(天津化学试剂研宄所）、KH2P04 (中国医药集团化学试剂有限公司）、盐酸 (韩国Duksan纯药公司）、甲醇（美国Dikma科技有限公司）、三氟乙酸（天津AifaAesar 试剂公司）、石英砂（上海天莲化学试剂有限公司）、阿散酸（德国Dr.EhronstorferGmbH 实验室，纯度99. 0% )、洛克沙砷（德国Dr.EhronstorferGmbH实验室，纯度99. 0% )、硝 苯胂酸（日本Wako和光纯药工业株式会社）、超纯水仪（美国Millipore有限公司）。
[0036] 标准贮备液的配置方法：准确称取阿散酸标准品50mg，置于50mL容量瓶中，加入 去离子水定容至50mL，超声水浴30min，使阿散酸标准品充分溶解，然后过0. 45um滤膜过 滤，即配置成l〇〇〇ugml/1阿散酸标准贮备液，置于棕色瓶中，放于冰箱中4°C保存。洛克沙 胂和肖苯砷酸标准储备液的配置也采用同样的步骤。
[0037] 三种形态砷化物混标溶液现用现配，配制方法：各取500uL上述阿散酸、洛克沙胂 和肖苯砷酸标准贮备液于50mL容量瓶中，加入去离子水定容至50mL，即配置成10ug ml/1阿 散酸、洛克沙胂和肖苯砷酸三种砷化物混合标准溶液。取此砷化物混标200uL置于2mL比 色管中，加入去离子水定容至2mL，即配置成lug ml/1三种砷化物混标。采用相同的方法， 配置0. lug mL'0. 4ug mL'lug mL'2ug ml/1四种不同浓度的三种不同形态砷化物混标。
[0038] 表1阿散酸、洛克沙胂和肖苯砷酸混标的配制方法
【主权项】
1. 一种基于hplc-hg-afs系统的砷元素形态分析仪器参数优化方法，其特征在于，该 方法包括以下步骤： 采用含0. 1% v/v三氟乙酸、0. 05mol I71磷酸二氢钾的5%甲醇水溶液作为流动相，在 流动相中加入三氟乙酸调整PH值，加入KH2PC^t缓冲盐，实进行高效液相色谱分离条件的 优化； 进行氢化物发生条件优化，具体包括： 选择盐酸和!^氏蠕动泵转速均为120r min '进行蠕动泵流速优化、在盐酸浓度为5% v/v的条件下，还原剂KBH4的浓度选为20g I71，进行还原剂浓度优化、在还原剂采用含5g PKOH的20g L4KbH4溶液的条件下，盐酸的浓度选为5%，进行盐酸浓度优化； 进行原子荧光检测器参数优化，具体包括： 选定330v为归一化标准值，进行光电倍增管高压；采用IOOmA空心阴极灯电流，进行空 心阴极灯电流优化；选定300mL mirT1为载气流速的最优值，进行载气流速优化；选择最小 的屏蔽气流量，达到最佳的屏蔽作用，进行屏蔽气流速优化； 在上述优化的条件下，分别选取0. 1~2ug ml/1阿散酸、洛克沙胂和肖苯砷酸三种形态 砷化物混标计算HPLC-HG-AFS系统的标准曲线。
【专利摘要】本发明公开了一种基于HPLC-HG-AFS系统的砷元素形态分析仪器参数优化方法，该方法包括以下步骤：高效液相色谱分离条件的优化、氢化物发生条件优化、原子荧光检测器参数优化，在上述优化的条件下，分别选取0.1～2ug·mL-1阿散酸、洛克沙胂和肖苯砷酸三种形态砷化物混标计算HPLC-HG-AFS系统的标准曲线。与现有技术相比，本发明在优化的条件下，该方法重复性好，准确度高。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104849358
【申请号】CN201510008851
【发明人】赵学玒, 汪曣, 杜康, 蒋学慧, 孙传强, 孙运, 代丽
【申请人】天津大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年1月8日