一种微流控免疫传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种微流控免疫传感器的制备方法，属于生物传感器技术领域。
【背景技术】
[0002]农业生产中超剂量滥用农药，造成农产品中农药残留的多样性和复杂性，对食品安全及人类健康构成了很大威胁。毒死蜱为一种广谱杀虫剂，被用于防治水稻、玉米、果树、蔬菜等方面的螟虫、蚜虫和螨类等害虫。毒死蜱在人体内累聚后，倘若高浓度可致使生命受到威胁。而近年来，毒死蜱的比例份额没有下降，反之，其需求量与日俱增。在大范围推广毒死蜱的同时，必然对人类健康构成了严重的威胁，因而有必要寻找一种现场、快速、准确且自动化程度高的农药多残留检测技术是保障农产品安全的有效途径。
[0003]传统的用于检测农药残留的分析方法有:气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫(ELISA)等，这些检测方法虽然精确度高，定量准确，但其样品的前处理复杂、检测耗时长、仪器设备昂贵、需要专业技术的操作人员，只适合实验室操作，不适宜现场快速检测。目前常用的酶抑制法(酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法)，可以实现有机磷农药的现场快速检测，具有较好的实用价值。但是，速测卡检测结果准确度低，一般只能用于严重超标的蔬菜样品的定性测量。酶抑制分光光度法的准确度低，检测结果受到蔬菜水果中色素和气味的影响。免疫传感器是基于抗原和抗体特异性结合所引发的免疫反应的原理所研制的传感器，与传统的分析方法相比，它具有特异性强、分析速度快、结构简单、成本低廉等优点。但目前免疫传感器的制备过程中，抗体(Ab)或半抗原(hapten)的固定化并保持其良好的生物活性、空间排布、信号的放大以及人工差异是制约传感器灵敏度、稳定性、选择性和重复性的关键因素。
【发明内容】
[0004]发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷、操作简单、灵敏度高，选择性好的检测农药残留的免疫传感器的制备方法。
[0005]其技术方案为:一种微流控免疫传感器的制备方法，其特征在于:在清洗干净的通入微流控通道内先后通入聚二烯丙基二甲基氯化铵(TODA)和纳米金胶，并重复两次，然后通入蛋白A液，获得修饰电极，再将毒死蜱抗体通入微通道内，干燥清洗后获得基于聚二烯丙基二甲基氯化铵O3DDA)/纳米金胶和蛋白A。毒死蜱抗体修饰的微流控免疫传感器。
[0006]所述方法步骤为:
1)微流控通道的清洗；
2)将聚二烯丙基二甲基氯化铵(TODA)、纳米金胶和蛋白A、毒死蜱抗体通入并固定在微流控通道内。
[0007]步骤I)所述，微流控通道的清洗:过程是，首先，用注射泵通入IM的氢氧化钠溶液15分钟后通入5分钟去离子水，氮气吹干，然后通入IM的盐酸溶液15分钟后通入5分钟去离子水后氮气吹干，在pH7.5的铁氰化钾溶液中扫描Bode曲线，如果能和电极初始时的Bode曲线重合则电极清洗干净，否则重新清洗。
[0008]步骤2)所述，将聚二烯丙基二甲基氯化铵(TODA)、纳米金胶和蛋白A、毒死蜱抗体通入并固定在微流控通道内:是先通入聚二烯丙基二甲基氯化铵(TODA) 10分钟，干燥后通入去离子水冲洗5分钟去掉未固定的H)DA，氮气吹干后通入纳米金胶10分钟，干燥后通入去离子水冲洗5分钟去掉未固定的纳米金胶，将上述过程重复一次。然后通入蛋白A液10分钟，干燥后通入去离子水冲洗5分钟去掉未固定的蛋白A，氮气吹干，通入毒死蜱抗体10分钟，干燥后通入去离子水冲洗5分钟去掉未固定的抗体，制备好聚二烯丙基二甲基氯化铵O3DDA)/纳米金胶和蛋白A修饰的微流控免疫传感器。
[0009]所述的一种微流控免疫传感器的制备方法，其特征在于:微流控芯片的清洗，免疫传感器敏感界面的构建及过程表征，免疫传感器工作曲线的建立，免疫传感器性能的检测，免疫传感器对实际样品的检测。
[0010]所述的一种微流控免疫传感器的制备方法，其特征在于:实验条件的优化，主要包括测试底液的pH、通入检测时间以及孵育时间；所制备的免疫传感器的工作曲线为:ΛΖ =163.0 + 70.000 IgC (ng/mL), (R2=0.9745.);免疫传感器性能检测包括特异性、稳定性、以及免疫传感器对多种果蔬样品回收率的测定。
[0011]其制备原理为:用聚二烯丙基二甲基氯化铵(roDA)和纳米金胶通过层层自主装来修饰微流控芯片内置的叉指阵列电极，提高电极稳定性和电极表面的生物亲和性；然后将蛋白A固定在纳米金胶上，再通过蛋白A与抗体Fe端的特异性结合定向将抗体牢固的固定在电极上。抗体的定向固定保持了抗体的生物活性以及自由的抗原结合位点来和农药有效的特异性结合。采用本发明制备的微流控免疫传感器可以在蔬果采收、上市前，进行农药毒死蜱残留的快速测定，直接对农药残留是否超标量进行检测，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
[0012]为达到以上目的，采取以下技术方案实现:一种微流控免疫传感器的制备方法，其特征在于:(I)微流控通道的清洗；(2)将聚二烯丙基二甲基氯化铵(roDA)、纳米金胶和蛋白A、毒死蜱抗体通入并固定在微流控通道内。
[0013]所述微流控免疫传感器的制备工艺如下:(I)将清洗干净的微流控芯片通入roDA10分钟，干燥后通入去离子水5分钟冲洗；(2)通入纳米金胶10分钟，干燥后通入去离子水5分钟冲洗；(3)将⑴和⑵重复一次；⑷通入蛋白AlO分钟，待干燥45分钟后通入5分钟去离子水冲洗去未固定上的蛋白A，通入毒死蜱抗体10分钟，干燥90分钟后通入去离子水冲洗5分钟去掉未固定的抗体。氮气吹干，微流控免疫传感器制作完成，保存在4°C条件下备用。
【附图说明】
[0014]图1 PA/AuNPS/PDDA/AU 传感器的 Nyquist 组装图
a、裸电极，b、修饰H)DA/AuNPS后的电极，C、修饰蛋白A后的电极，d、固定抗体后的电极，e、结合毒死蜱后的电极；
本试验在包含 5.0 mmol/L [Fe (CN) 6] 3-/4-和 0.1 mol/L KCl 的 0.1 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲液中进行EIS表征。如图1所示，微流控芯片未经修饰的裸电极阻抗值(曲线a)，当TODA/AuNPS自主装修饰后电极后，阻抗值明显减小(曲线b )，因为AuNPS具有优良的导电性。当蛋白A修饰电极后，阻抗值明显增大(曲线C)，纳米金胶提高了电极的稳定性和生物亲和性，使得蛋白A更好地结合在电极上，因蛋白A大分子物质阻碍了电子传递，电流减小阻抗增大；当毒死蜱抗体在蛋白A的定向固定作用下固定在电极上后，阻抗值明显增大(曲线d)，当毒死蜱农药