一种速灭威压电免疫传感器及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种速灭威压电免疫传感器及其制备方法，在压电石英晶体金电极表面滴涂多壁碳纳米管和聚酰胺-胺树型分子复合物，借助树型分子表面大量活性氨基自组装固定速灭威多克隆抗体，实现对氨基甲酸酯类农药速灭威的直接定量检测。该发明将多壁碳纳米管的高比表面积、聚酰胺-胺树型分子表面活性基团和石英晶体微天平的高灵敏度检测的特点有效结合，构建过程简单，条件易于控制。所构建的压电传感器具有灵敏度高、重现性好等优点，可用于苹果汁、橙汁等样品中速灭威分析检测。
【专利说明】一种速灭威压电免疫传感器及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及传感和免疫分析【技术领域】，尤其涉及一种速灭威压电免疫传感器及其制备方法。
【背景技术】
[0002]速灭威(Metolcarb)是一种速效性氨基甲酸酯类杀虫剂，纯品为白色结晶性粉末，难溶于水，易溶于甲醇、丙酮等有机溶剂，在碱性和高温条件下很容易分解。目前被广泛应用于稻田、蔬菜、水果等作物的害虫防治，具有触杀、熏杀、内吸作用，属于高效、低毒类杀虫剂。对哺乳动物的半致死量(以小鼠计)为268mg.kg'食用被速灭威污染的食品之后，会在生物体内容易蓄积，造成潜在的威胁。目前为止，国内外普遍使用的速灭威检测方法主要包括高效液相色谱法、高效液相色谱与质谱联用法、酶联免疫法等等，但这些分析方法所用的分析仪器价格相对昂贵，检测成本较高，或存在操作繁琐，不适宜大规模推广等弊端或缺点。
[0003]压电免疫传感器是一种将抗原-抗体特异性结合的生物信号转变成为质量信号，并通过石英晶体谐振频率对其进行定量、定性分析检测的传感器。其将抗原-抗体结合的特异性和高灵敏度与压电传感器的便携、灵敏高等特征有效结合，在食品安全现场、快速分析检测中发挥了越来越重要的作用。对于一个高性能免疫传感器的构建过程，实现抗体分子在传感换能器表面的有效固定是一个关键参数。修饰的抗体量及其稳定能力对免疫传感器的灵敏度和稳定能力存在重要影响。多壁碳纳米管具有较大的比表面积和较好的生物相容性，常被用于生物传感器中生物活性分子的修饰基底，但是其在水相的团聚造成构建的传感器信号不稳定、可重复性差。聚酰胺-胺树型分子在内部存在稳定的空腔，表面存在大量表面活性氨基，具有良好的分散性能和生物相容性，并对蛋白质大分子有良好的负载，将其修饰在多壁碳纳米管表面有助于提高纳米管的水相分散能力和对抗体分子的吸附能力，进而提高免疫传感器的整体性能。
【发明内容】
[0004]本发明创造要解决的问题是提供一种速灭威压电免疫传奇及其制备方法，改善多壁碳纳米管的水相分散性能，并提高其抗体负载量，并用于速灭威含量的测定。
[0005]为解决上述技术问题，本发明创造采用的技术方案是:一种速灭威压电免疫传感器，在石英晶体金电极表面滴涂多壁碳纳米管与聚酰胺-胺树型分子复合物，并自组装速灭威多克隆抗体。
[0006]本发明还提供了一种制备如上所述的速灭威压电免疫传感器的方法，包括如下的制备步骤:
[0007]I)、多壁碳纳米管经浓硝酸与浓硫酸的混合液加热回流2-4小时，优选为2小时，然后用二次水冲洗至中性，干燥备用；
[0008]2)、将步骤I)处理后的多壁碳纳米管超声分散于水中，加入EDC和NHS，再加入聚酰胺-胺树型分子复合物，于室温条件下搅拌2小时；然后将混合物转移到透析袋中，透析12-36小时，优选为透析24小时，室温干燥后既得多壁碳纳米管与聚酰胺-胺树型分子复合物；其中，EDC为1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS为N-羟基丁二酰亚胺；
[0009]3)、取步骤2)中制备的复合物，加水，超声分散至均浆，得到复合物匀浆，滴涂于石英晶体金电极表面，室温干燥。
[0010]4)、将步骤3)中制备的表面修饰复合物的石英晶体电极浸没于速灭威多克隆抗体溶液中自组装抗体，石英晶体每次一片，但是晶体片的面积不一定，固定恒温恒湿保存6-10小时，优选为8小时；加牛血清蛋白溶液封闭，经二次水清洗后，既得速灭威压电免疫传感器。
[0011]优选的，步骤I)中浓硝酸与浓硫酸的混合液中浓硝酸与浓硫酸的体积比为1:3。
[0012]优选的，步骤2)中，所述透析袋的分子量范围为8000?14000，所述聚酰胺-胺树型分子复合物为4.0代分子，表面有64个活性氨基。
[0013]优选的，步骤I)中所述多壁碳纳米管的直径为20?30nm，长度为30 μ m，比表面积为 110m2/g ；
[0014]优选的，步骤2)中，多壁碳纳米管、EDC、NHS和聚酰胺-胺树型分子复合物质量比为 1:18-22:18-22:3_7，优选为 1:20:20:5。
[0015]优选的，步骤3)中，所述复合物匀浆中复合物与水的质量体积比为2:3-7，优选为2:5。
[0016]优选的，步骤3)中，石英晶体电极表面上混合物匀浆的涂覆量为8-15，优选为10微升。
[0017]优选的，步骤4)中，速灭威多克隆抗体溶液用量为0.5-1.5毫升，优选为1.0毫升，浓度为2-8微克每毫升，优选为5微克每毫升，牛血清蛋白溶液用量为0.5-1.5毫升，优选为1.0毫升，质量浓度为0.2%-2%，优选为1%。
[0018]本发明如上所述的速灭威压电免疫传感器在速灭威含量测定中的应用
[0019]本发明创造具有的优点和积极效果是:本发明提供的多壁碳纳米管和聚酰胺-胺树型分子复合物在水相中分散性能好，化学性质稳定，同时通过化学法制备，易于获得。将多壁碳纳米管的高比表面积、聚酰胺-胺树型分子表面活性基团和石英晶体微天平的高灵敏度检测等特点有效结合，所构建的压电免疫传感器对速灭威具有较高的选择识别能力和检测灵敏度。本发明成本低廉，实验操作简单，反应条件容易控制，构建的压电免疫传感器检测灵敏度高、重现性好，适用于果汁样品中速灭威快速、灵敏检测。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实施例，对本发明作进一步说明。
[0021]本发明提供的一种速灭威压电免疫传感器，在石英晶体金电极表面滴涂多壁碳纳米管与聚酰胺-胺树型分子复合物，并自组装速灭威多克隆抗体。将压电传感技术与免疫分析技术相结合，开发以多壁碳纳米管与聚酰胺-胺树型分子复合物为传感基底的压电免疫传感器，并对速灭威进行分析检测。
[0022]实施例一
[0023]一、石英晶体金电极的预处理
[0024]石英晶体金电极经无水乙醇清洗后，浸没于30% H2O2与98% H2SO4混合溶液(I:3, v/v)中5分钟,取出，用大量水和乙醇冲洗,晾干备用。
[0025]二、速灭威压电免疫传感器的制备
[0026](1)0.5克多壁碳纳米管经20毫升浓硝酸/浓硫酸混合液(1/3，v/v)加热回流2小时，二次水冲洗至中性，干燥备用。
[0027](2)取羧化后多壁碳纳米管5.0毫克超声分散于水中，加入EDC和NHS各100毫克，加入含有聚酰胺-胺树型分子(4.0代)25毫克的甲醇溶液1.0毫升，室温搅拌2小时。将混合物转移到透析袋(分子量范围:8000-14000)中，透析24小时，室温干燥后得多壁碳纳米管与聚酰胺-胺树型分子复合物。
[0028](3)取复合物2.0毫克置于5.0毫升水中，超声分散至均浆，取10微升滴涂于石英晶体金电极表面，室温干燥。
[0029](4)将复合物修饰的石英晶体电极浸没于1.0毫升速灭威多克隆抗体浓度为5.0微克每毫升的溶液中，恒温恒湿保存8小时；加1.0mL牛血清蛋白溶液(1.0% )封闭，经二次水清洗后，既得速灭威压电免疫传感电极。
[0030]实施例二
[0031]一、石英晶体金电极的预处理
[0032]石英晶体金电极经无水乙醇清洗后，浸没于30% H2O2与98% H2SO4混合溶液(I:3, v/v)中5分钟,取出，用大量水和乙醇冲洗,晾干备用。
[0033]二、速灭威压电免疫传感器的制备
[0034](1)0.5克多壁碳纳米管经20毫升浓硝酸/浓硫酸混合液(1/3，v/v)加热回流3小时，二次水冲洗至中性，干燥备用。
[0035](2)取羧化后多壁碳纳米管5.0毫克超声分散于水中，加入EDC和NHS各100毫克，加入含有聚酰胺-胺树型分子(4.0代)25毫克的甲醇溶液1.0毫升，室温搅拌2小时。将混合物转移到透析袋(分子量范围:8000-14000)中，透析16小时，室温干燥后得多壁碳纳米管与聚酰胺-胺树型分子复合物。
[0036](3)取复合物2.0毫克置于5.0毫升水中，超声分散至均浆，取15微升滴涂于石英晶体金电极表面，室温干燥。
[0037](4)将复合物修饰的石英晶体电极浸没于1.0毫升速灭威多克隆抗体浓度为8.0微克每毫升的溶液中，恒温恒湿保存8小时；加1.0mL牛血清蛋白溶液(1.0% )封闭，经二次水清洗后，既得速灭威压电免疫传感电极。
[0038]实施例三
[0039]一、石英晶体金电极的预处理
[0040]石英晶体金电极经无水乙醇清洗后，浸没于30% H2O2与98% H2SO4混合溶液(I:
3,v/v)中5分钟,取出，用大量水和乙醇冲洗,晾干备用。
[0041]二、速灭威压电免疫传感器的制备
[0042](1)0.5克多壁碳纳米管经20毫升浓硝酸/浓硫酸混合液(1/3，v/v)加热回流4小时，二次水冲洗至中性，干燥备用。
[0043](2)取羧化后多壁碳纳米管5.0毫克超声分散于水中，加入EDC和NHS各100毫克，加入含有聚酰胺-胺树型分子(4.0代)25毫克的甲醇溶液1.0毫升，室温搅拌2小时。将混合物转移到透析袋(分子量范围:8000-14000)中，透析48小时，室温干燥后得多壁碳纳米管与聚酰胺-胺树型分子复合物。
[0044](3)取复合物2.0毫克置于5.0毫升水中，超声分散至均浆，取8微升滴涂于石英晶体金电极表面，室温干燥。
[0045](4)将复合物修饰的石英晶体电极浸没于1.0毫升速灭威多克隆抗体浓度为5.0微克每毫升的溶液中，恒温恒湿保存10小时；加1.0mL牛血清蛋白溶液(1.0% )封闭，经二次水清洗后，既得速灭威压电免疫传感电极。
[0046]将实施例一~实施例三中制备的速灭威压电免疫传感电极固定于传感流通池中，记录晶体谐振频率fo (Hz)，加入50.0微升速灭威标准溶液，稳定后记录谐振频率fi (Hz)，并计算频率变化Af，其中Af = 。在速灭威浓度为0.1-50.0毫克每毫升范围内，与频率变化Af呈现良好的线性关系，回归方程为Af = 36.312Cra+33.26 (R2 = 0.9861)，检出限为0.019晕克每升。
[0047]利用制备的速灭威压电免疫传感器对苹果汁、橙汁样品进行加标回收实验。
[0048]实施例一测定结果如下表所示:
[0049]
【权利要求】
1.一种速灭威压电免疫传感器，其特征在于:在石英晶体金电极表面滴涂多壁碳纳米管与聚酰胺-胺树型分子复合物，并自组装速灭威多克隆抗体。
2.一种制备如权利要求1所述的速灭威压电免疫传感器的方法，其特征在于，包括如下的制备步骤: 1)、多壁碳纳米管经浓硝酸与浓硫酸的混合液加热回流_2_4小时，优选为2小时，然后用二次水冲洗至中性，干燥备用； 2)、将步骤I)处理后的多壁碳纳米管超声分散于水中，加入EDC和NHS，再加入聚酰胺-胺树型分子复合物，于室温条件下搅拌2小时；然后将混合物转移到透析袋中，透析12-36小时，优选为透析24小时，室温干燥后既得多壁碳纳米管与聚酰胺-胺树型分子复合物；其中，EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；NHS为N-羟基丁二酰亚胺； 3)、取步骤2)中制备的复合物，加水，超声分散至均浆，得到复合物匀浆，滴涂于石英晶体金电极表面，室温干燥。 4)、将步骤3)中制备的表面修饰复合物的石英晶体电极浸没于速灭威多克隆抗体溶液中自组装抗体，恒温恒湿保存6-10小时，优选为8小时；加牛血清蛋白溶液封闭，经二次水清洗后，既得速灭威压电免疫传感器。
3.根据权利要求2所述的速灭威压电免疫传感器的制备方法，其特征在于:步骤I)中浓硝酸与浓硫酸的混合液中浓硝酸与浓硫酸的体积比为1:3。
4.根据权利要求2或3所述的速灭威压电免疫传感器的制备方法，其特征在于:步骤2)中，所述透析袋的分子量范围为8000?14000，所述聚酰胺-胺树型分子复合物为4.0代分子，表面有64个活性氨基。
5.根据权利要求4所述的速灭威压电免疫传感器的制备方法，其特征在于:步骤I)中所述多壁碳纳米管的直径为20?30nm，长度为30 μ m,比表面积为110m2/g。
6.根据权利要求5所述的速灭威压电免疫传感器的制备方法，其特征在于:步骤2)中，多壁碳纳米管、EDC、NHS和聚酰胺-胺树型分子复合物质量比为1:18-22: 18-22:3_7，优选为 1:20:20:5。
7.根据权利要求5或6所述的速灭威压电免疫传感器的制备方法，其特征在于:步骤3)中，所述复合物匀浆中复合物与水的质量体积比为2:3-7，优选为2:5。
8.根据权利要求7所述的速灭威压电免疫传感器的制备方法，其特征在于:步骤3)中，石英晶体电极表面上混合物匀浆的涂覆量为8-15，优选为10微升。
9.根据权利要求8所述的速灭威压电免疫传感器的制备方法，其特征在于:步骤4)中，速灭威多克隆抗体溶液用量为0.5-1.5毫升，优选为1.0毫升，浓度为2-8微克每毫升，优选为5微克每晕升,牛血清蛋白溶液用量为0.5-1.5晕升,优选为1.0晕升,质量浓度为0.2% -2%，优选为 1%。
10.如权利要求1所述的速灭威压电免疫传感器在速灭威含量测定中的应用。
【文档编号】G01N33/544GK104198700SQ201410447600
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】王硕, 王俊平, 潘明飞 申请人:天津科技大学