专利名称：用于检测噻虫啉的免疫传感器及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种化学检测技术领域的装置和方法，具体的是采用石墨烯纳米材料，应用于测定溶液中噻虫啉的免疫生物传感器及其制备方法。
背景技术：
噻虫啉(Thiacloprid)为新烟碱类农药，是一种新的对刺吸口器害虫有高效的广谱杀虫剂。农药作为对环境和食品的重要污染源之一，越来越受到各国政府和公众的关注， 有大约100多种化学农药会破坏人体激素平衡，很多的化学农药含有致癌物质；农药除了可造成人体的急性中毒外，绝大多数对人体产生的慢性危害，多是通过污染食品造成的。中国是农产品出口大国，中国出口的农产品由于农药残留量超过国际标准，影响了农产品的出口创汇和在国际市场上的竞争力，造成了很大的经济损失。因此，寻找噻虫啉快速准确的测定技术仍是人们的迫切希望，研究意义重大。目前应用最多的噻虫啉的测定方法主要有液相色谱、液质连用法、高效液相色谱等。但是这些分析方法需要大型分析仪器，过程操作繁琐，不能实现现场检测。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于检测噻虫啉的免疫传感器及其制备方法，所述传感器通过石墨烯、纳米金颗粒和壳聚糖之间的有机结合，准确、高效的检测出溶液中的噻虫啉，其检出限可达纳克级，且检测方法简便、快速、对环境友好、同时也很经济。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种用于检测噻虫啉(3-(6-氯-3-吡啶基)甲基-1，3-噻唑啉_2_亚基)氰胺)的免疫传感器，包括电极、沉积在所述电极上的纳米金颗粒层、涂布于所述纳米金颗粒层上的石墨烯-壳聚糖层、涂布于所述石墨烯-壳聚糖层上的噻虫啉层、和涂布于所述噻虫啉层上的BSA层。较佳的，所述电极为玻碳电极，优选经Al2O3粉末液打磨抛光后的玻碳电极，优选所述Al2O3的粒径为I. O和O. 3 μ m ;所述纳米金颗粒为LHAuCL4,优选100mg/LHAuCL4溶液；所述石墨烯-壳聚糖中所述石墨烯壳聚糖的质量比为5 2，优选所述壳聚糖为lmg/mL壳聚糖溶液；所述BSA为质量分数为5%的BSA溶液。本发明还公开了一种制备所述免疫传感器的方法，包括以下步骤I、制备所述石墨烯-壳聚糖的混合溶液a.壳聚糖溶液的配制，将0.05M的HCL加热至80_90°C，加入壳聚糖，搅拌溶液，冷却后加入浓度为O. IM的NaOH，调节PH至7，制备得到壳聚糖溶液，优选使其浓度为lmg/mL ；b.将石墨烯溶于所述壳聚糖溶液中，优选石墨烯所述壳聚糖溶液的比例为5mg 2mL,超声分散,优选Ih,制得石墨烯-壳聚糖悬浮液；2、将电极，优选玻碳电极，经Al2O3粉末液打磨抛光后，分别在无水乙醇和水中各超声3min，优选I. O和O. 3 μ m的Al2O3粉末液；3、将所述电极上先沉积纳米金颗粒，然后将所述石墨烯-壳聚糖的悬浮液滴在电极上，再将噻虫啉溶液滴在电极上，37°C下烘干，最后置于37°C下浸泡在质量分数为5%的BSA溶液中30min。在一较佳实施方式中，所述步骤3中所述沉积纳米金颗粒的方法为将电极置于纳米金颗粒溶液中，优选100mg/LHAuCL4溶液，在-O. 2V电势下恒电位扫描60s。在另一较佳实施方式中，优选所述噻虫啉溶液的浓度为O. 2g/L。本发明还公开了一种检测噻虫啉的方法将所述免疫传感器浸入含有不同浓度的游离噻虫啉和效价浓度为I : 6400的噻虫啉的单克隆抗体的磷酸缓冲溶液中，优选磷酸缓冲溶液的PH为7. 4，浓度为O. lmol/L;并于37°C孵育40min ;用磷酸缓冲溶液冲洗后于2mM的K3Fe(CN)6溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描，扫描范围是-O. 2V至O. 5V，振幅O. 05，脉冲宽度O. 05s，取样宽度O. 02s，脉冲周期O. 2s，弛豫时间2s。实验结果显示，随着噻虫啉在孵育液中浓度的增加，DPV峰电流增大。定义在只含有噻虫啉抗体的孵育液中孵育的修饰电极的DPV峰电流为Itl，含有游离噻虫啉抗原的孵育液中孵育后的修饰电极的DPV峰电流为Ix，并计算Λ I = Ix-I0,以Λ I对噻虫啉浓度(C)作图可得到线性曲线。噻虫啉浓度在范围内l_4000ng/mL与Λ I成正比，斜率为O. 00202，线性相关系数为O. 97728。本发明有如下的有益效果由于石墨烯有大的比表面积且能够很好的促进生物电活性分子的电子传递，壳聚糖对许多离子、有机物、生物分子具有离子交换和吸附等特性。因此，本发明的固定噻虫啉抗体的免疫电化学传感器可以在常温下，稳定而迅速的检测残留噻虫啉的浓度。
图I为所述免疫传感器的竞争机制工作原理示意图图2为噻虫啉在不同条件下的循环伏图。图3为实施例中免疫传感器检测不同浓度的噻虫啉的DPV曲线图。图4为图3中电流的变化Λ I与噻虫啉浓度的线性曲线图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例做详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施给出了详细的实施方案和具体的操作过程。但本发明的保护范围不限于下述的实施例。以下实施例中，免疫传感器的制备方法为
I、壳聚糖溶液的配制，将O. 05Μ的HCL加热至80_90°C，加入称量好的壳聚糖，搅拌溶液，冷却后加入浓度为O. IM的NaOH，调节PH至7，制备得到浓度为lmg/mL的壳聚糖溶液；2、称取5mg石墨烯溶于2mL步骤I中lmg/mL壳聚糖溶液中，超声分散Ih,制得石墨烯-壳聚糖悬浮液；3、将直径为3mm的玻碳电极分别经I. O和O. 3 μ m的Al2O3粉末液打磨抛光后，分别在无水乙醇和水中各超声3min ；4、将步骤3中最终所得的玻碳电极先置于100mg/LHAuCL4溶液中，在_0. 2V电势下恒电位扫描60s,然后在电极表面滴涂4μ L石墨烯-壳聚糖的悬浮液,再将2μ L0. 2g/L的噻虫啉滴在电极上，37°C下烘干；最后置于37°C下浸泡在质量分数为5%的BSA溶液中30min,制备得到本实施例中的免疫传感器。
本实施例中磷酸缓冲溶液的pH为7. 4，浓度为O. lmol/L。本实施例中差分脉冲伏安(DPV)扫描的扫描范围是-O. 2V至O. 5V，振幅O. 05，脉冲宽度O. 05s，取样宽度O. 02s，脉冲周期O. 2s，弛豫时间2s。图I为本实施例检测检测噻虫啉的原理图，当免疫传感器进入含有噻虫啉的抗体的孵育液中时，孵育液中游离的噻虫啉与固定在电极上噻虫啉竞争与溶液中的噻虫啉抗体反应。抗体吸附在电极上引起以KJFe(CN)6]电化学信号的改变，从而实现对噻虫啉的检测；图中(a)溶液中游离的噻虫啉与固定在电极上的噻虫啉竞争与溶液中的抗体反应，(b)电极清洗后置于2禮的K3 [Fe (CN)6], (c)电化学检测。实施例I :免疫传感器对噻虫啉的检测将上述制备好的免疫传感器浸入总体积为50 μ L的含有不同浓度的游离噻虫啉溶液中，和效价浓度为I : 6400的噻虫啉的单克隆抗体的磷酸缓冲溶液中，在37°C孵育40min，用磷酸缓冲溶液冲洗后于2mM的K3Fe (CN) 6溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描。本实施例中磷酸缓冲溶液的pH为7. 4，浓度为O. lmol/L。本实施例中差分脉冲伏安(DPV)扫描的扫描范围是-O. 2V至O. 5V，振幅O. 05，脉冲宽度O. 05取样宽度O. 02s，脉冲周期O. 2s，弛豫时间2s。实验结果显示，随着噻虫啉在孵育液中浓度的增加，DPV峰电流增大。图2为噻虫啉循环伏安结果图，裸电极(曲线A)在2mM的KjFe(CN)6]的PBS溶液中的循环伏安曲线表现出一对明显的Fe (CN) 63_/4_氧化还原峰；当电极上修饰了石墨烯/噻虫啉/壳聚糖后(曲线B)，峰电流明显增大，石墨烯显示出优异的电化学活性，增强了电子的传递；当电极上修饰了纳米金/石墨烯/噻虫啉/壳聚糖后(曲线C)，峰电流强度更大，纳米金和石墨烯的复合材料显示出了更加优越的电化学性能；将纳米金/石墨烯/噻虫啉/壳聚糖修饰电极放入含有噻虫啉抗体的孵育液中孵育后(曲线D)，峰电流下降，这是由于噻虫啉抗体与电极上的噻虫啉抗原反应，吸附在电极上，阻碍了电子的传递造成的，这也说明噻虫啉抗原已经修饰在了电极上。图3为免疫传感器在(a)只含有8 μ L效价浓度为I : 6400的噻虫啉的单克隆抗体，含有SyL效价浓度为I : 6400的噻虫啉抗体和不同浓度的游离的噻虫啉(b)4000ng/mL, (c) 3000ng/mL, (d)2000ng/mL, (e)500ng/mL, (f)50ng/mL, (g)lOng/mL, (h)lng/mL(i) Ong/mL的孵育液中孵育40min后，在2mM的K3 [Fe (CN) 6]的PBS溶液中的DPV曲线图。随着噻虫啉浓度在孵育液中的增加，DPV峰电流增大。也就是说，游离的噻虫啉浓度越高，固定在电极上的噻虫啉分子结合的抗体越少。定义在只含有噻虫啉抗体的孵育液中孵育的修饰电极的DPV峰电流为Itl，孵育后的修饰电极的DPV峰电流为Ix，并计算Λ I = Ix-I0,以Δ I对噻虫啉浓度(C)作图可得到线性曲线(图4)。噻虫啉浓度在范围内l_4000ng/mL与Δ I成正比，斜率O. 00202,线性相关系数为O. 97728。实施例2 西红柿实际样品中加标噻虫啉的测定步骤一，西红柿样品的处理称取2±0. 0050g西红柿匀浆于IOmL的4个样品管中，样品4中加入200 μ L0. 2g/L噻虫啉标准液，样品3中加入100 μ L0. 2g/L噻虫啉标准液，样品2中加入25 μ L0. 2g/L唾虫琳标准液，样品I中不加，并在4个样品管中依次加入3mL乙腈，混合物超声振荡30min，于2000r/m下离心lOmin，将上清液转移至氮吹管中。提取物在氮吹条件下于50°C温度下浓缩蒸发，浓缩物加入ImL的pH为7. 4的O. lmol/L磷酸缓冲溶液溶解后用于电化学分析。步骤二，西红柿实际样品中加标噻虫啉的测定分别取5 μ L的不同西红柿提取液样品，和8 μ L效价浓度为I : 6400的噻虫啉抗体溶液及pH为7. 4的O. lmol/L的磷酸缓冲溶液混合配成孵育液，使得各孵育液总体积为50 μ L，且噻虫啉单抗体浓度相同，将免疫电极插入孵育液中，在37°C孵育40min，用磷酸缓冲溶液冲洗后于2mM的K3Fe (CN)6溶液中进 行差分脉冲伏安(DPV)扫描。去空白样品的峰电流为Itl，其他样品的峰电流Ix，并计算ΛΙ=Ix-Itl，，查工作曲线(图4)得到噻虫啉浓度，回收率结果如表I表I为免疫传感器检测加标西红柿中的噻虫啉浓度的回收率
噻虫啉添加量噻虫啉测定量回收率(％)
(ng/mL)__(ng/mL)__
500.0377.,3，92.9
560.4,456.5---
2000.02213.9,1728.8,199 98.9
__6Λ__
4000.04728.7,4035.6,399 106.3 _\_6Λ__实施例3 :苹果实际样品中加标噻虫啉的测定步骤一，苹果样品的处理称取2±0. 0050g苹果匀浆于IOmL的4个样品管中，样品4中加入200，样品3中加入100 μ L0. 2g/L噻虫啉标准液μ L0. 2g/L噻虫啉标准液，样品3中加入100 μ L0. 2g/L噻虫啉标准液，样品2中加入25 μ L0. 2g/L噻虫啉标准液，样品I中不加，并在4个样品管中依次加入3mL乙腈,混合物超声振荡30min,于2000r/m下离心lOmin，将上清液转移至氮吹管中。提取物在氮吹条件下于50°C温度下浓缩蒸发，浓缩物加入ImL的pH为7. 4磷酸缓冲溶液溶解后用于电化学分析。步骤二，苹果实际样品中加标噻虫啉的测定分别取5μ L的不同苹果提取液样品，和8 μ L效价浓度为I : 6400的噻虫啉抗体溶液及PH为7. 4的O. lmol/L磷酸缓冲溶液混合配成孵育液，使得各孵育液总体积为50 μ L，且噻虫啉单抗体浓度均相等，将修饰好的电极进入孵育液中，在37°C孵育40min，用磷酸缓冲溶液冲洗后于2mM的K3Fe (CN) 6溶液中进行差分脉冲伏安(DPV)扫描。去空白样品的峰电流为Itl，其他样品的峰电流Ix，并计算Δ I = Ix-Itl，，查工作曲线(图4)得到噻虫啉浓度，回收率结果如表2表2为免疫传感器检测加标苹果中的噻虫啉浓度的回收率
权利要求
1.一种用于检测噻虫啉的免疫传感器，包括电极，其特征在于还包括沉积在所述电极上的纳米金颗粒层、涂布于所述纳米金颗粒层上的石墨烯-壳聚糖层、涂布于所述石墨烯-壳聚糖层上的噻虫啉层、和涂布于所述噻虫啉层上的BSA层。
2.根据权利要求I所述所述的免疫传感器，其中，所述电极为玻碳电极。
3.根据权利要求I所述所述的免疫传感器，其中，所述电极经Al2O3粉末液打磨抛光。
4.根据权利要求I所述所述的免疫传感器，其中，所述纳米金颗粒为LHAuCL4。
5.根据权利要求I所述所述的免疫传感器，其中，所述石墨烯-壳聚糖中所述石墨烯壳聚糖的质量比为5 2。
6.根据权利要求I所述所述的免疫传感器，其中，所述BSA为质量分数为5%的BSA溶液。
7.一种制备权利要求1-6任一所述免疫传感器的方法，包括以下步骤 A、制备所述石墨烯-壳聚糖的混合溶液 a.壳聚糖溶液的配制，将O.05M的HCL加热至80_90°C，加入壳聚糖，搅拌溶液，冷却后加入浓度为O. IM的NaOH，调节pH至7，制备得到壳聚糖溶液； b.将石墨烯溶于所述壳聚糖溶液中，超声分散，制得石墨烯-壳聚糖悬浮液； B、将电极经Al2O3粉末液打磨抛光后，分别在无水乙醇和水中各超声3min； C、将步骤B中超声后的电极上先沉积纳米金颗粒，然后将所述石墨烯-壳聚糖的悬浮液滴在电极上，再将噻虫啉溶液滴在电极上，37°C下烘干，最后置于37°C下浸泡在BSA溶液中 30min。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述步骤C中所述沉积纳米金颗粒的方法为将所述超声后的电极置于纳米金颗粒溶液中，在-O. 2V电势下恒电位扫描60s。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述纳米金颗粒溶液为100mg/LHAuCL4溶液。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，所述噻虫啉溶液的浓度为O.2g/L。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测噻虫啉的免疫传感器及其制备方法，所述传感器通过石墨烯、纳米金颗粒和壳聚糖之间的有机结合，根据检测前后电流的变化，以及不同浓度的噻虫啉将导致免疫传感器的检测电流也不同的原理，准确、高效的检测出溶液中的噻虫啉，其检出限可达纳克级，且检测方法简便、快速、稳定、对环境友好、同时也很经济。
文档编号G01N33/577GK102636643SQ20121009986
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者吴珺, 张芹, 王正武, 米芹, 赵波, 邵科峰, 陈昌云 申请人:上海交通大学