一种竞争型黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于食品检测和生物传感【技术领域】，其公开了一种快速检测黄曲霉毒素的竞争型免疫传感器。其制作方案及检测方法是：以丝网印刷电极为工作电极，通过电沉积法修饰一层银纳米粒子，然后依次加入黄曲霉毒素抗体、牛血清白蛋白、黄曲霉毒素以及负载铜离子羟基磷灰石标记的抗原混合溶液，以稀硫酸溶解负载铜离子羟基磷灰石，使其内部的铜离子释放出来，使黄曲霉毒素的检测转化为铜离子的检测，实现了较高的灵敏度，检测限可低至0.1ng/kg。
【专利说明】
一种竞争型黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于食品检测与生物传感【技术领域】，具体涉及一种快速检测黄曲霉毒素的丝网印刷电极免疫传感器。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素(Aflatoxins)是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，主要有B1、B2、Gl、G2以及另外两种代谢产物Ml、M2。其中Ml和M2是从牛奶中分离出来的。B1、B2、Gl、G2、Ml和M2在分子结构上十分接近。
[0003]黄曲霉毒素是目前发现的最强的致癌物质，其致癌力比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍，黄曲霉毒素BI的半数致死量为0.36mg/kg体重，属特剧毒的毒物范围。它引起人的中毒主要是损害肝脏，发生肝炎肝硬化，肝坏死等。临床表现有胃部不适、食欲减退，恶心呕吐，腹胀及肝区触痛等，严重者出现水肿昏迷，以至抽搐而死。
[0004]黄曲霉毒素在农产品中几乎无法避免，农业生产中，黄曲霉毒素超标的玉米并不少见。国家卫生部门禁止企业使用被严重污染的粮食进行食品加工生产，并制定相关的标准监督企业执行。但黄曲霉毒素即使含量很低依旧会对人体健康造成侵害，很难进行控制。
[0005]1995年,世界卫生组织制定的食品黄曲霉毒素最高允许浓度为15Pg/kg ;美国联邦政府有关法律规定人类消费食品和奶牛饲料中的黄曲霉毒含量(指B1+B2+G1+G2的总量)不能超过15Pg/kg ;人类消费的牛奶中的含量不能超过0.5Pg/kg，其他动物饲料中的含量不能超过30(^g/kg。而欧盟国家规定更加严格，花生和坚果及其加工产品、所有谷类食品及加工产品中黄曲霉毒素BI限量为2.0Pg/kg ;原奶、热处理奶及加工奶产品中Ml限量为0.05(^g/kg ;婴儿食品(包括婴幼儿奶)中Ml限量为0.025Pg/kg。
[0006]目前国内绝大多数检测机构都在使用薄膜层析法和液相色谱法进行黄曲霉毒素的检测。由于其检测周期长，程序复杂所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。本发明采用丝网印刷电极，价格低廉，结合电化学技术和竞争免疫分析方法，提高了传感器的选择性并大大提高了检测的灵敏度，节省了检测时间，降低了检测成本。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于避免传统检测方法的仪器设备复杂、操作过程繁琐、检测人员要求高、检测成本高等缺点，提供了一种灵敏度高、特异性强、重现性好、操作简便且价廉易得的检测黄曲霉毒素的丝网印刷电极免疫传感器的制备方法。
[0008]为了实现上述目的，本发明是通过以下措施来实现的。本发明的技术方案，包括以下步骤。
[0009]1.一种竞争型黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法，包括以下步骤:
(O负载铜离子的羟基磷灰石标记抗原的制备
将粒径2(T60nm的纳米羟基磷灰石和硫酸铜以质量比为1:1飞的比例混合，溶于5?15mL水中，震荡12?24小时，离心分离； 取5?10 mg获得的负载铜离子的纳米羟基磷灰石，溶于5?15mL磷酸盐缓冲溶液，加入0.Γ0.2ml浓度为lPg/mL的黄曲霉毒素抗原溶液，孵化震荡4?8小时，离心分离；
将获得的负载铜离子的羟基磷灰石标记抗原重新加入5?15mL磷酸盐缓冲溶液，并加入Img的牛血清白蛋白，孵化震荡4?8小时，离心分离；
将沉淀重新分散到5?10mL磷酸盐缓冲溶液中，即获得负载铜离子的羟基磷灰石标记抗原的储备液；
(2)竞争型黄曲霉毒素免疫传感器的制备
在丝网印刷电极上加入50μ?含有0.05mmol/L硝酸银、0.2mmol/L柠檬酸钠和0.05mol/L硝酸钾的水溶液，连接电化学工作站，以-0.2V进行恒电位沉积，沉积时间为3(Tl80s，晾干，制得银纳米粒子修饰的丝网印刷电极；
在丝网印刷电极上滴加5?1PL浓度为lPg/mL的黄曲霉毒素抗体溶液，孵化f 4小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净；
在丝网印刷电极上滴加5?1PL的浓度为1%牛血清白蛋白溶液，孵化f 4小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净；
在丝网印刷电极上滴加5?10μ?的体积比为f 5:1的黄曲霉毒素、负载铜离子的羟基磷灰石标记抗原混合溶液，孵化广4小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净，即制得竞争型黄曲霉毒素免疫传感器。
[0010]2.一种竞争型黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法，用于黄曲霉毒素的检测包括以下步骤:
(1)工作曲线的绘制
采用不同浓度的黄曲霉毒素按照I中所述的方法制备一系列丝网印刷电极免疫传感器；
将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入50μ?的醋酸盐缓冲溶液，再加入5?10μ?的1%的稀硫酸溶液，将负载铜离子的羟基磷灰石溶解，释放出铜离子；
设定电位范围为-0.6^0.4V，沉积电位为-0.8V，沉积时间为10(T300s，通过阳极溶出线性伏安法检测修饰好的丝网印刷电极的电流响应；
根据所得电流响应与黄曲霉毒素浓度的关系，绘制工作曲线；
(2)黄曲霉毒素的检测
采用5?10μ?待测样品取代步骤(I)中的黄曲霉毒素，其它与步骤(I)相同；
根据所测得的数值，对照黄曲霉毒素的工作曲线，计算出样品中黄曲霉毒素的含量。
[0011]本发明具备以下优势:
(1)本发明采用的负载铜离子羟基磷灰石具有良好的生物相容性，同时其可溶于酸性溶液，原位释放出铜离子，不需要转移和稀释，从而提高了检测灵敏度，使黄曲霉毒素的检测限可低至0.1 ng/kg，远低于检测要求
(2)本发明不需前处理，快速、准确，可用于复杂样品中的黄曲霉毒素的检测。
【具体实施方式】
[0012]实施例一本发明所述的负载铜离子的羟基磷灰石标记抗体的制备，步骤如下:
(1)将粒径30nm的纳米羟基磷灰石和硫酸铜以质量比为1:3的比例混合，溶于5mL水中，震荡12小时，离心分离；
(2)取5mg获得的负载铜离子的纳米羟基磷灰石，溶于5mL磷酸盐缓冲溶液，加入0.1ml浓度为I Kg/mL的黄曲霉毒素抗体溶液，孵化震荡4小时，离心分离；
(3)将获得的负载铜离子的羟基磷灰石标记抗体重新加入5mL磷酸盐缓冲溶液，并加入Img的牛血清白蛋白，孵化震荡4小时，离心分离；
(4)将沉淀重新分散到5mL磷酸盐缓冲溶液中，即获得负载铜离子的羟基磷灰石标记抗体的储备液。
[0013]实施例二
本发明所述的竞争型黄曲霉毒素免疫传感器的制备，步骤如下Cl)在丝网印刷电极上加入50μ?含有0.05mmol/L硝酸银、0.2mmol/L柠檬酸钠和0.05mol/L硝酸钾的水溶液，连接电化学工作站，以-0.2V进行恒电位沉积，沉积时间为120s，晾干，制得银纳米粒子修饰的丝网印刷电极；
(2)在丝网印刷电极上滴加1PL浓度为lPg/mL的黄曲霉毒素抗体溶液，孵化I小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净；
(3)在丝网印刷电极上滴加1PL的浓度为1%牛血清白蛋白溶液，孵化I小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净；
(4)在丝网印刷电极上滴加1PL的体积比为2:1的黄曲霉毒素、负载铜离子的羟基磷灰石标记抗原混合溶液，孵化I小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净，即制得竞争型黄曲霉毒素免疫传感器。
[0014]实施例三
实施例广2中任一所述的一种竞争型黄曲霉毒素免疫传感器，用于黄曲霉毒素的检测，包括以下步骤:
(1)采用不同浓度的黄曲霉毒素按照实施例广2中任一所所述的方法制备一系列丝网印刷电极免疫传感器；
(2)将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入50μ?的醋酸盐缓冲溶液，再加入5?10μ?的1%的稀硫酸溶液，将负载铜离子的羟基磷灰石溶解，释放出铜离子；
(3)设定电位范围为-0.6^0.4V，沉积电位为-0.8V，沉积时间为10(T300s，通过阳极溶出线性伏安法检测修饰好的丝网印刷电极的电流响应；
(4)根据所得电流响应与黄曲霉毒素浓度的关系，绘制工作曲线；
实施例四
采用1PL待测样品取代实施例三中的黄曲霉毒素，其它与实施例三相同；
根据所测得的数值，对照黄曲霉毒素的工作曲线，计算出样品中黄曲霉毒素的含量。
【权利要求】
1.一种竞争型黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)负载铜离子的羟基磷灰石标记抗原的制备 将粒径2(T60nm的纳米羟基磷灰石和硫酸铜以质量比为1:1飞的比例混合，溶于5?15mL水中，震荡12?24小时，离心分离； 取5?10 mg获得的负载铜离子的纳米羟基磷灰石，溶于5?15mL磷酸盐缓冲溶液，加入0.Γ0.2ml浓度为lPg/mL的黄曲霉毒素抗原溶液，孵化震荡4?8小时，离心分离； 将获得的负载铜离子的羟基磷灰石标记抗原重新加入5?15mL磷酸盐缓冲溶液，并加入Img的牛血清白蛋白，孵化震荡4?8小时，离心分离； 将沉淀重新分散到5?10mL磷酸盐缓冲溶液中，即获得负载铜离子的羟基磷灰石标记抗原的储备液； (2)竞争型黄曲霉毒素免疫传感器的制备 在丝网印刷电极上加入50μ?含有0.05mmol/L硝酸银、0.2mmol/L柠檬酸钠和0.05mol/L硝酸钾的水溶液，连接电化学工作站，以-0.2V进行恒电位沉积，沉积时间为3(Tl80s，晾干，制得银纳米粒子修饰的丝网印刷电极； 在丝网印刷电极上滴加5?1PL浓度为lPg/mL的黄曲霉毒素抗体溶液，孵化广4小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净； 在丝网印刷电极上滴加5?1PL的浓度为1%牛血清白蛋白溶液，孵化f 4小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净； 在丝网印刷电极上滴加5?10μ?的体积比为f 5:1的黄曲霉毒素、负载铜离子的羟基磷灰石标记抗原混合溶液，孵化广4小时，并用磷酸盐缓冲溶液清洗干净，即制得竞争型黄曲霉毒素免疫传感器。
2.—种竞争型黄曲霉毒素免疫传感器的制备方法，用于黄曲霉毒素的检测，其特征在于，包括以下步骤: (1)工作曲线的绘制 采用不同浓度的黄曲霉毒素按照权利要求1中所述的方法制备一系列竞争型黄曲霉毒素免疫传感器； 将参比电极、对电极和工作电极连接在电化学工作站上，在电解槽中加入50μ?的醋酸盐缓冲溶液，再加入5?10μ?的1%的稀硫酸溶液，将负载铜离子的羟基磷灰石溶解，释放出铜离子； 设定电位范围为-0.6^0.4V，沉积电位为-0.8V，沉积时间为10(T300s，通过阳极溶出线性伏安法检测修饰好的丝网印刷电极的电流响应； 根据所得电流响应与黄曲霉毒素浓度的关系，绘制工作曲线； (2)黄曲霉毒素的检测 采用5?10μ?待测样品取代步骤(I)中的黄曲霉毒素，其它与步骤(I)相同； 根据所测得的数值，对照黄曲霉毒素的工作曲线，计算出样品中黄曲霉毒素的含量。
【文档编号】G01N33/569GK104374913SQ201410622503
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月8日 优先权日:2014年11月8日
【发明者】王欢, 魏琴, 张以河, 庞雪辉, 吴丹, 张勇, 马洪敏, 范大伟 申请人:济南大学