0的反应体系为最优的反应体系。
[0026] 图3为考察高浓度膜蛋白酶对后续磯酸肤的富集W及串联质谱鉴定的影响，分别 考察了八组不同酶/蛋白的比例，由最终鉴定到的磯酸肤的数目，验证了高浓度的膜蛋白 酶对后续的磯酸肤的富集W及质谱鉴定都毫无任何不利影响。
[0027] 图4为将该方法用于磯酸化蛋白质组学分析时，图4(a)为膜蛋白酶浓度的考察情 况；图4(b)为反应时间的考察情况。
[0028] 图5为将所述的磯酸化蛋白质组样品快速处理方法，用于磯酸化蛋白质组学分析 的质谱鉴定数据，和每步的处理过程所必须耗费的时间，实验组和对照组都分别进行了H 次技术重复实验，图中所示的磯酸化位点的鉴定结果为H次重复实验的综合数据。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1
[0030] 细胞裂解-蛋白酶解的反应体系的考察：各取100000化La细胞样品放置于如下 五种反应体系内，分别是；1) 2Murea缓冲溶液；2) 0. 8%NP-40缓冲溶液；3) 12mMsodium deo巧cholate(SDC)缓冲溶液；4)2Murea和 0. 8〇/〇NP-40 缓冲溶液；5)2Murea和 12mMSDC 缓冲溶液，该五种缓冲溶液都分别包含了lOmMDTT和地os地atase;[]111113；[1:0八即ImMNaF 和ImM化3V04)，接着向溶液内加入3(K)ng/yL的膜蛋白酶，振荡器上润旋震荡数十砂直至 全部细胞膜破裂，然后将该混合物置于37C水浴超声器内超声赔育比，最后，通过离也力 可控的且填充了ImgTi-IMC材料的GELoaderTip离也器进行磯酸肤富集，将所得磯酸肤 段室温冻干，复溶在100yL0. 1% (v/v)甲酸中进行RPLC-MS/MS分析，使用人数据库进行 谱图搜索和数据处理后得到定性结果。
[0031] 如图2所示，通过比较五种不同的反应体系，得知有尿素存在的反应体系，普遍鉴 定到了最少的磯酸肤，相反，在两种只含有表面活性剂的反应体系内，运用此方法进行磯酸 化蛋白质组学的快速分析，获得了较优的鉴定结果，考虑到表面活性剂NP-40为实验室常 用试剂，因此偏向于选择此种反应体系。
[00础 实施例2
[0033] 高浓度膜蛋白酶对磯酸肤富集和质谱鉴定的影响；分别向200yg的化La酶解液 中加入一系列不同酶/蛋白比例的膜蛋白酶，混匀之后，用2mgTi-IMC材料进行富集。磯 酸肤富集步骤如下；将材料用80%ACN6%TFA重息之后，与酶解液W体积比为1:1的比例进行 混合，室温下震荡30min，待充分富集后，在1350化pm的转速下离也3min，弃上清液，然后依 次用溶液50%ACN6%TFA200mM化C1和30%ACN6%TFA分别洗涂一次，震荡30min，如上所述，高 速离也去除上清液，最后用10%NH3 ?&0溶液洗脱磯酸肤两次，如实施例1所述，进行后续质 谱鉴定。
[0034] 如图3所示，横坐标轴上的数字代表加入的过量的酶/蛋白比例，其中数字"0"意 味着没有任何过量酶的加入。因此，由图可W看出，反应体系内过量膜蛋白酶的存在对后续 磯酸肤的富集和串联质谱的鉴定并无任何明显的不利影响，甚至于当膜蛋白酶的量已经为 蛋白量的10倍时，仍然对后续的实验鉴定无明显影响。
[00对 实施例3
[0036] 磯酸化蛋白质组样品快速处理方法的反应条件的优化；分别考察了该反应所需 要的最佳膜蛋白酶浓度和反应时间。将四组100000化La细胞样品加入50yL0. 8%NP-40 的反应体系内，然后分别加入20ng/]iL10化g/yL30化g/yL1.Oyg/yL的膜蛋白酶， 将此溶液在振荡器上润旋震荡数十砂钟直至全部细胞膜破碎，接着将此混合物溶液放置 于37C水浴超声器内超声赔育比，最后，通过离也力可控的且填充了ImgTi-IMC材料的 GELoaderTip离也器进行磯酸肤富集，如实施例1所述，进行后续质谱鉴定。
[0037] 如上所述，待考察完最佳的膜酶浓度后，将四组100000化La细胞样品加入 50yL0. 8%NP-40的反应体系内，然后加入3(K)ng/yL的膜蛋白酶，将此溶液在振荡器上润 旋震荡数十砂钟直至全部细胞膜破碎，接着将此混合物溶液放置于37C水浴超声器内，分 别超声赔育25min，45min，比，先超声赔育比然后水浴过夜酶解。将该四组样品进行如上的 磯酸肤富集，如实施例1所述，继续进行后续质谱鉴定。
[0038] 如图4(a)所示，该用于磯酸化蛋白质组学分析时，随着膜酶浓度的不断增加，鉴 定到的磯酸肤的数量也在不断增加，直至到达一个平台（300ng/uL的膜蛋白酶)，自此之 后，磯酸肤的鉴定数量不再随着酶浓度的增加而增加，由此可见，在3(K)ng/yL的膜蛋白酶 浓度，反应时间为Ih的反应条件下，蛋白已经基本完全酶解了。在此基础之上，继续优化反 应时间，由图4(b)可知，磯酸肤的鉴定数量随着反应时间的增加并无明显的增加趋势，可 见反应时间缩短至25min同样可W实现完全的细胞裂解和蛋白的酶解。
[0039] 实施例4
[0040] 用于磯酸化蛋白质组学的快速分析：将100000化La细胞样品加入50yL反应体系 内，然后加入300ng/]iL的膜蛋白酶，将此溶液在振荡器（ScientificIndustriesVortex Genie2)上润旋震荡数十砂钟直至全部细胞膜破碎，接着将此混合物溶液放置于37°C水浴 超声器（比朗化3-120B)内超声赔育25min，最后，通过离也机控制，离也力为2000g，且填 充了Img固定化金属铁离子亲和色谱材料（Ti-IMAC)的GELoaderTip枪头内（Eppendo;rf GELoaderTip20yL)进行磯酸肤富集，将所得磯酸化肤段放入冻干机中设置温度为室温下 冻干，得到磯酸化肤段，得到的磯酸化肤段复溶在lOOyL0.l%(v/v)甲酸中进行RPLC-MS/ MS分析，使用人数据库进行谱图搜索和数据处理后得到定性结果。由图5所示，本发明在样 品处理阶段所耗费的时间远远低于两个对照正常组，与此同时，在磯酸化位点的鉴定上，却 获得了相对较优的鉴定量，验证了本发明的准确性和高效性。
[0041] 本发明为一种基于高浓度膜蛋白酶的样品处理方法，它集细胞裂解，蛋白提取和 蛋白酶解于一体，是一种可W用于磯酸化蛋白质组学快速分析的方法。众所周知，高浓度的 膜蛋白酶可W促进蛋白酶解，但是却存在严重的自酶解现象不利于下游质谱的鉴定，但是 经过验证，在磯酸化蛋白质组学分析中，因为磯酸肤富集该一步骤的存在，使得该一劣势变 得微不足道。可W推断，该一种磯酸化蛋白质组样品快速处理方法中，同时进行的两个过 程：细胞裂解和蛋白酶解其实是一个相互促进的过程，细胞的裂解促进了蛋白的酶解，同时 反过来，蛋白质的酶解也促进了细胞的进一步裂解，相互促进，相互加速，使得该一原本繁 琐费力的过程只需在短短25min内就可W轻松实现。将其应用于磯酸化蛋白质组学的分 析，最终的质谱鉴定数据证明了该种样品处理方法的准确性和高效性，获得了比对照正常 组更优的磯酸化位点的鉴定量。该种样品处理方法为磯酸化蛋白质组学的研究和发展，提 供了一个新的方法和技术平台。
【主权项】
1. 一种磷酸化蛋白质组样品快速处理方法，其特征在于： 具体步骤如下： (1) 将数量为10000-500000个的HeLa细胞样品加入50-100 ii L反应体系内； (2) 将上述步骤（1)得到的反应体系加入胰蛋白酶后在振荡器上涡旋震荡至全部细胞 膜破碎； (3) 将上述步骤（2)中得到的混合物溶液放置于30-40°C水浴超声器内超声孵育； (4) 在上述步骤（3)中通过离心机控制的、且填充了 800 ii g-2mg固定化金属钛离子亲 和色谱材料（Ti-IMAC)的GELoader Tip枪头内进行磷酸肽富集，将所得磷酸化肽段放入冻 干机冻干；得处理后的磷酸化蛋白质组样品。2. 根据权利要求1所述的磷酸化蛋白质组样品快速处理方法，其特征在于： 将上述步骤（4)中得到的磷酸化肽段复溶在IOOyLO. 1%体积浓度的甲酸中进行RP LC-MS/MS 分析。3. 根据权利要求1所述的磷酸化蛋白质组样品快速处理方法，其特征在于：步骤（1)中 所述的反应体系是细胞裂解-蛋白酶解的反应体系，细胞裂解-蛋白酶解的反应体系是含 有0. 5%-1. 0%体积分数乙基苯基聚乙二醇，5-10mM二硫苏糖醇和磷酸酶抑制剂的50-100mM Tris-HCl (pH7. 8-8. 5)缓冲溶液。4. 根据权利要求3所述的磷酸化蛋白质组样品快速处理方法，其特征在于： 所述反应体系中的磷酸酶抑制剂组成为〇. 5-1. 5mM氟化钠和0. 5-1. 5mM正钒酸钠，pH 为 7. 8-8. 5。5. 根据权利要求1所述的磷酸化蛋白质组样品快速处理方法，其特征在于：步骤（2) 所述反应体系中的胰蛋白酶的浓度为250ng/ii L-L 0 ii g/ii L。6. 根据权利要求1所述的磷酸化蛋白质组样品快速处理方法，其特征在于：步骤（3)超 声孵育反应时间为25min-lh。7. 根据权利要求1所述的磷酸化蛋白质组样品快速处理方法，其特征在于：步骤（4)离 心机的离心力为1000g-3000g，所述冻干机设置温度为室温。8. 根据权利要求1所述的磷酸化蛋白质组样品快速处理方法，其特征在于：所采用的 富集方式是将Ti-IMC富集材料填充至GELoader Tip枪头内，借用1000g-3000g离心力进 行富集。9. 根据权利要求1所述的磷酸化蛋白质组样品快速处理方法，其特征在于：将该样品 处理方法应用于磷酸化蛋白质组学快速分析，可获取相应的磷酸肽和磷酸化位点的鉴定结 果，该结果可以用于翻译后修饰蛋白质组学分析。
【专利摘要】本发明涉及一种磷酸化蛋白质组样品快速处理方法，利用高浓度胰蛋白酶可以促进蛋白快速酶解的优势，发展了一种新型、综合细胞裂解和蛋白酶解于一体的样品处理方法，并将其应用于磷酸化蛋白质组学的分析。得益于高浓度的胰蛋白酶同时促进了细胞裂解和蛋白酶解这一深层机理，细胞样品只需一步即可完成到肽段混合物的快速转变，在磷酸肽富集过程中，非磷酸化肽段以及其他各种质谱不兼容的杂质，均可被去除。本发明仅需25min即可实现从细胞到肽段之间的快速转变，而在对照正常组中，最简易的方法也至少需要16h；并且通过HeLa实际细胞样品的分析，获得了比对照组较优的质谱鉴定覆盖率，证明了这种样品预处理方法的准确性和高效性。
【IPC分类】G01N1/28
【公开号】CN104949864
【申请号】CN201410114497
【发明人】邹汉法, 刘芳洁, 叶明亮
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2014年3月25日