FasL蛋白作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及人化sL蛋白作为生物标记在定性检测大肠 癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。
【背景技术】
[0002] Aspirin(阿司匹林），化学名己酷水杨酸，是20世纪初德国化学家化lix化ffman 合成的一个结构简单的小分子化合物。阿司匹林是世界上使用最多，使用时间最长（至今 已有100多年的使用历史），且不会产生药物依赖性的非酱体抗炎药。流行病学和临床试 验表明，Aspirin除了用于解热、抗血小板凝聚等，还可防治包括结大肠癌（CRC)、食道癌、 肺癌在内的多种肿瘤。其中，对大肠癌的肿瘤抑制作用尤为突出，是Lancet、New化gland JournalofMedcine、JAMA等权威杂志持续关注的热点。
[0003] 大肠癌是一种常见的恶性肿瘤，据美国癌症协会2014年报告（CA)，美国大肠癌新 发病例数及死亡病例数均居全部恶性肿瘤的第3位；在我国大肠癌发病率与死亡率亦呈明 显上升趋势，且呈现出年轻化趋势。尽管我国大肠癌基础研究与早期干预有较大进步，但发 病率与死亡率仍呈明显上升趋势。大约50~60%大肠癌患者出现肝转移，其5年存活率可 超过40%。
[0004] 研究证明大肠癌等恶性肿瘤中存在肿瘤干细胞（CancerstemCell;CSC)，CSC 是一群具有很强的自我更新能力和多向分化潜能的细胞，虽在肿瘤细胞中所占比例很小， 但在放化疗后出现明显富集并产生治疗抗性，是大肠癌治疗和控制复发转移的难点所在。 Aspirin虽然对大肠癌具有较强的肿瘤抑制作用，但是Aspirin对不同的恶性肿瘤或同种 肿瘤的不同类型的个体治疗效果存在差异性。目前Aspirin用于大肠癌临床辅助治疗面临 的主要难题是缺乏指导个体化用药的参考指标，对病人的用药缺乏针对性，其疗效也很难 预测。此外，随着Aspirin临床应用的不断增加，其耐药性及其副作用的出现是限制其临床 应用的重要原因，如何在清除肿瘤干细胞的同时尽量减少其副作用也是Aspirin临床应用 中要解决的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明通过检测大肠癌的普通肿瘤细胞（W下简称AC细胞）和大肠癌干细胞（W 下简称TC细胞）对Aspirin的敏感性发现Aspirin选择性清除TC细胞，在此基础上进一 步检测TC细胞中调亡相关基因的变化，发现Aspirin选择性上调TC细胞中化sL基因的表 达水平，说明化sL蛋白是Aspirin的应答蛋白。
[0006] 本发明还发现TC细胞对Aspirin的敏感性与TC细胞中化sL蛋白的表达水平呈 正相关，即阻断化sL蛋白与Fas结合后，Aspirin对TC细胞的生长抑制作用消失，TC细胞 调亡减少对TC中化sL蛋白进行封闭实验，进一步验证了阿司匹林诱导的化sL蛋白表达 水平的上调为直肠癌干细胞对阿司匹林的敏感性所必须。
[0007] 基于W上发现，本发明提供了化sL蛋白作为生物标记在定性检测大肠癌干细胞 对阿司匹林敏感性中的应用，所述化si蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0008] 本发明所述定性检测是指检测大肠癌干细胞是否对阿司匹林敏感，一般情况下， 如Aspirin处理后，大肠癌干细胞中化sL蛋白的表达量是使用前的两倍，则认定该直肠癌 干细胞对Aspirin敏感。
[0009] 本发明还提供了能够与权利要求1所述化sL蛋白特异性结合的抗体在制备定性 检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性的试剂中的应用。
[0010] 所述的抗体可W是完整的抗体分子、嵌合抗体、单链抗体、双特异性抗体、抗体重 链、抗体轻链、重链和轻链的同二聚体和异二聚体，W及抗原结合片段和衍生物。完整的抗 体分子可W是多抗或单抗，优选为单抗。
[0011] 所述定性检测可W采用流式细胞分析，采用该方法使用的抗体需携带巧光标记， 巧光标记如PE等。
[0012] 蛋白表达包括转录和翻译两个过程，蛋白表达水平的提高，转录的mRNA含量也必 然提高，基于此，本发明又提供了编码权利要求1所述化sL蛋白的mRNA作为生物标记在定 性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。
[0013] 本发明还提供了能够与所述mRNA特异性结合的探针或引物在制备定性检测大肠 癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。
[0014] 所采用的方法一般为定量PCR。
[0015] 所述引物可W是扩增整个mRNA的引物，也可W是扩增mRNA特征区域的引物，所述 探针是识别mRNA特定区域的核巧酸，一般携带标识。
[0016] 根据实施例的记载，本发明提供了一对具体扩增所述mRNA的引物，如下所示：
[0017] 上游引物；5' -GCAGCAGCCCTTCAATTACCCAT-3，
[0018]下游引物；5 ' -CACAGAGGTTGGACAGGGAAGAA-3，。
[0019] 本发明还发现Aspirin主要通过促进化sL基因启动子区的册蛋白脚己酷化上 调大肠癌干细胞中化sL基因的表达水平，基于此，本发明还提供了己酷化册K9蛋白作为生 物标记在定性检测大肠癌干细胞对阿司匹林敏感性中的应用。
[0020] 所述己酷化册K9蛋白是指册蛋白的第9个氨基酸K己酷化，所述册蛋白的氨基 酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0022] 本发明发现Aspirin选择性清除大肠癌的肿瘤干细胞，并且Aspirin明显上调大 肠癌肿瘤干细胞中化sL蛋白的表达水平，因此化sL是Aspirin应答蛋白，通过检测化sL基 因或化sL蛋白在肿瘤干细胞中的表达水平，可W准确、快速地评估肿瘤干细胞对Aspirin 的敏感性，从而直接在基因转录与蛋白质表达或修饰水平上评价Aspirin的有效性和毒副 作用。
【附图说明】
[0023] 图1A为用不用浓度的Aspirin处理不同来源的大肠癌干细胞与普通肿瘤细胞 后的细胞存活率比较图；其中，Asp表示Aspirin(阿司匹林），HT29为人大肠癌细胞系， P1为人大肠癌原代细胞系，TC表示大肠癌干细胞，AC表示大肠癌普通肿瘤细胞，cell Vi油)表示细胞存活率（％ )，"*"表示差异显著，下同。
[0024]图1B为用不用浓度的Aspirin处理不同来源的大肠癌干细胞后的巧光显微镜观 察图；其中，Asp(ml)表示阿司匹林浓度（ml),DAPI表示对活细胞进行细胞核染色后的巧光 显微镜观察结果，TU肥L表示对调亡细胞进行染色后的巧光显微镜观察结果，MDC表示对自 瞻泡进行染色后的巧光显微镜观察结果，下同。
[00巧]图1C为用不用浓度的Aspirin处理不同来源的大肠癌干细胞后细胞调亡率统计 图；其中，ApoptoticCell(%)表示细胞调亡率（％ )，下同。
[0026] 图1D为利用定量PCR技术筛选Aspirin处理不同来源的大肠癌干细胞后细胞内 各调亡基因表达水平的变化；其中，TC(usedas1)表示将TC中的基因表达水平作为1， TC+Asp表示用Aspirin处理大肠癌干细胞后，Control表示Aspirin处理大肠癌干细胞前， NormalizedExpression表不标准化后表达水平，下同。
[0027] 图1E为利用定量PCR技术筛选Aspirin处理不同来源的大肠癌普通肿瘤细胞后 细胞内各调亡基因表达水平的变化；其中，AC(usedas1)表示将AC中基因表达水平作为 1，AC+Asp表示用Aspirin处理大肠癌普通肿瘤细胞后，Control表示Aspirin处理大肠癌 普通肿瘤细胞前。
[0028] 图1F为利用流式细胞术检测Aspirin处理大肠癌干细胞后化sL表达水平的改 变。
[0029] 图1G为利用流式细胞术检测Aspirin处理大肠癌干细胞后化sL表达水平统计 图。
[0030] 图1H为利用流式细胞术检测Aspirin处理大肠癌普通肿瘤细胞后化sL表达水平 的改变。
[0031] 图II为