在免疫传感器中测量， 该有效地独立于转运速率和电极动力学，但为可检测物质例如通过酶ALP(附着至信号抗 体）从对氨基苯基磯酸醋生成的对氨基苯酪的酶促产生率的函数。
[0079]通过在晶片上的微电极上旋转涂覆PVA+有机化晚盐（sti化izonium)光敏交联剂 的含水混合物来制备多孔PVA层。旋转涂覆混合物任选任选地包括牛血清白蛋白炬SA)。 随后对旋转涂覆混合物进行光图案化W仅覆盖传感器阵列上方和周围的区域，并且优选具 有约0.6ym的厚度。
[0080] 参照图3,显示了单衬底上几个电极的掩模设计。通过掩模和蚀刻技术，可沉积独 立的电极和导线。因此，多个传感器150和155(例如主传感器和减弱的传感器）W及电导 测定传感器160和165可与各自的用于实现与读数装置的电连接的连接垫170、175、180和 185-起W低成本提供在盒的紧凑区域上。原则上，可该种方式组装非常大的传感器阵 列，其各自对不同的分析物敏感或用作对照传感器或参照传感器。如上所述，主传感器和减 弱的传感器可进一步包括生物层，而参照传感器可例如从缺乏生物层的金电极或从银电极 或其它合适的材料构建。不同的生物层可给每个传感器提供传感不同分析物的能力。
[0081] 在本发明的优选实施方案中，多个传感器150和155可如下制备。可将娃晶片热氧 化W形成大约1ym的绝缘氧化物层。将铁/鹤层可瓣射在氧化物层上至igG_1GG0A之 间的优选厚度，接着瓣射一层最优选800A厚的金。接着，将光致抗蚀剂旋制在晶片上，并 且可适当地干燥和烘赔。随后使用接触掩膜例如相应于图3中显示的掩膜暴露表面。使潜 像显影，并可使晶片暴露于金-蚀刻剂。用光可限定的聚酷亚胺涂覆图案化的金层，适当地 烘赔，使用接触掩膜进行曝光、显影，在〇2浆中进行清洁，优选在350°c舰化5小时。可对晶 片背侧进行任选的金属化W用作阻性加热元件，其中免疫传感器将W恒温器形式使用。随 后可用抗体涂覆的微粒（例如生物层）打印表面。将优选具有约20化体积并且包含去离 子水中1 %固体内含物的微滴沉积在传感器区域上并且通过风干原位干燥。任选地，可将抗 体稳定试剂（由SurModicaCo巧.或AETLtd供应）外涂覆在传感器上。干燥微粒使得所 述微粒W阻止在样品或包含底物的流体中溶解的方式粘附至传感器的表面。有利地，此方 法提供了可靠且可重现的适用于制造高容量的传感器巧片的固定方法。
[0082] 每个传感器可进一步被制造成包含至少一个巧片，其包括被配置为监测样品区段 到达传感器的电导传感器。传感器上的样品区段的到达时间可用来检测盒内的泄漏。例如 传感器上样品到达的延迟可指示盒内的泄漏。此外，电导传感器可被配置为测定传感器管 道内的样品区段的位置，W使得样品区段可使用样品后缘作为标志物来主动地控制。例如 随着样品/空气界面跨过传感器，可产生精确的信号用作可从其执行受控流体偏移的流体 标记物。样品区段可优先在传感器上边缘至边缘地振荡W将整个样品区段呈递至传感器表 面。例如可将第二试剂引入传感器之外的传感器管道，其在流体振荡期间变得均匀分布。
[0083] 用于钩状效麻檢测的微粒试剂
[0084] 基于微粒的免疫测定通常采用微粒（U巧乳胶作为固相支持物用于酶联免疫吸 附测定巧LISA)中的免疫吸附。所述微粒可用识别并特异性结合祀分析物的分析物特 异性免疫球蛋白（Ig)或抗体（例如固定抗体）来涂覆。在一些实施方案中，将Ig-涂 覆的微粒（uP-Igl)打印并不可逆地吸附在主传感器（例如电化学传感器）上。可将 可溶性缀合物（例如共价连接至酶的第二分析物特异性抗体（Ig2)，例如信号抗体） 与样品混合，并且可使混合物与主传感器接触从而导致在主传感器上形成夹屯、（例 如，uP-lgl一抗原一Ig2-Enz)。设计和配置底物W使得酶可作用于底物W形成电 活性产物，其可产生跨过主传感器（例如电极）的电流或电势。
[0085] 在本发明的优选实施方案中，"减弱的"微粒（au巧试剂可通过用少于Ig的完全 覆盖度（例如减弱或减少的覆盖度）涂覆微粒来形成W使得减弱的微粒试剂覆盖度可仅为 意欲用于主传感器的微粒试剂的覆盖度的约2%，任选意欲用于主传感器的微粒试剂的覆 盖度的0. 5至20%、覆盖度的1至10%、或覆盖度的1至5%。例如当特定的微粒可吸附每 单位重量微粒的"X"个Ig分子时，auP可通过吸附aX个Ig分子来获得，其中a<l。在一些 实施方案中，该可通过用"a"单位的分析物特异性Ig和（1-a)单位的共吸附物（例如非特 异性的Ig和/或蛋白）的混合物涂覆uP来完成。共吸附物稀释吸附在减弱的传感器上的 微粒上的分析物特异性Ig的表面活性。本领域技术人员应理解，uP和auP的相对分析物 特异性Ig的涂覆可基于主传感器和减弱的传感器响应的观察针对免疫测定的期望动态范 围的具体区域中的灵敏度、分析物浓度的准确度w及钩状效应检测比或信号水平进行最优 化。
[0086] 可选择地，减弱的UP试剂可通过适合于实现期望的减弱或减少的覆盖度的量的 抗体的连续吸附来获得。非特异性Ig可W是例如小鼠或山羊IgG。分析物特异性的Ig还 可用其它蛋白质例如BSA或人血清白蛋白化SA)或用任何合适的共吸附物来稀释，所述共 吸附物用于稀释微粒上的分析物特异性Ig的表面活性的目的（例如示例性抗-HAS小珠的 制备描述于美国专利No. 7, 723, 099中）。本领域技术人员应理解，用纯化至非特异性结合 的非-Ig区实现减弱的微粒试剂覆盖度的任何方法可提供期望的钩状效应检测或扩展动 态范围而不背离本发明的精神和范围。
[0087] 在一些实施方案中，结合至uP的分析物特异性Ig可包括针对祀分析物的第一亲 和力并且和结合至auP的分析物特异性Ig可包括针对祀分析物的第二亲和力。第一亲和 力可与第二亲和力不同或相同。例如高亲和力的分析物特异性Ig可结合至uP并且低亲和 力的分析物特异性Ig可结合至auP。来自相对较高的亲和力的分析物特异性Ig的信号在 较高的分析物浓度下达到稳定状态，而来自低亲和力的分析物特异性Ig基本上线性地响 应较高的分析物浓度。因此，来自相对较高亲和力的分析物特异性Ig的信号可用于低分析 物浓度的测量，该确保了免疫测定的灵敏度；而来自相对较低亲和力的分析物特异性Ig的 信号可用于较高的分析物浓度测定，该扩大了免疫测定的动态范围。
[0088] 在另一个实施方案中，减弱的uP试剂可通过W期望的目标比率混合两种微粒试 剂来制备，例如用HAS或其它的非特异性修饰的uPW期望的目标比率混合抗-分析物涂覆 的uP。
[0089] 图4显示了完全覆盖Ig-uP和减弱的微粒（au巧的信号产生特性。所记录的信号 或免疫传感器响应被记录在原型bHCG测定中作为分析物浓度的函数。具体地，空屯、圆200 描述打印有完全覆盖Ig-UP(fcIg-U巧的免疫传感器的响应，并且十字形210描述打印有减 弱覆盖度的Ig-auP的免疫传感器的响应。Ig-auP通过共吸附抗-bHCGMab和非特异性动 物IgGW2:98质量比的混合物来制备。如图4所显示的，fcIg-uP响应函数（空屯、圆200) 在分析物浓度0至1500IU/LbHCG的范围上是显著非线性的。另一方面，Ig-auP响应函数 (十字形210)是具有比fcIg-uP响应函数（空屯、圆200)更低信号的的显著更线性的响应。 因此，Ig-auP的行为可寻求为实现更线性的响应或实现比完全覆盖Ig-uP的信号更低的总 信号。
[0090] 如上所讨论的，当分析物浓度是如此之高W至于微粒试剂上的所有结合位点和/ 或酶-缀合物上的所有结合位点W包含固定UP试剂上的酶标记的夹屯、的形成被削弱的程 度结合祀分析物时，发生钩状效应。在该种情况下，信号产生可显着减少从而导致假阴性信 号。该在图4中显示为在所测试的bHCG的最高浓度例如300, 00IU/L下绘制的响应。例如 fcIg-uP涂覆的传感器在浓度300, 000IU/L下产生与1500IU/LbHCG的浓度大致相同的净 信号。另一方面，在auP涂覆的传感器产生实际上为零的信号。1500和300, 000IU/L的样 品信号之间的差异示出了包括auP试剂的减弱的传感器的效用。在减弱的传感器不存在 的情况下，在300, 000IU/L的浓度下来自主传感器的结果可被错误地报告在大约1000至 1500IU/L的范围中。然而，减弱的传感器（例如钩状效应参照传感器）提供了正确表征的 结果，并可被报告为"〉1500IU/L"。因此，显然的是，对单个测试装置（例如盒测定）内的传 感器上的微粒组成的裁剪可提供定量祀分析物的浓度和检测钩状效应的存在的能力。
[0091] 具体地，读数装置的处理器可被配置为在来自减弱的传感器的第二信号很高（任 选高于第一阔值）并且来自主传感器的第一信号同量地高（任选高于第二阔值）时确定钩 状效应的不存在或缺乏。此外，所述处理器可被配置为在来自减弱的传感器的第二信号较 低（任选低于第一阔值）并且来自主传感器的第一信号较高（任选高于第二阔值）时当确 定钩状效应的存在。在一些实施方案中，处理器可基于第一和第二信号的相对值确定第一 和的第二信号的比率，并基于所确定的比率确定免疫测定中钩状效应的存在或不存在。此 夕F，处理器可被配置为基于钩状效应的存在或不存在和第一和第二信号的相对值确定祀分 析物的浓度。
[0092] 在一些实施方案中，可提供至少一种另外的传感器，其包含相对于主传感器和减 弱的传感器的分析物特异性Ig的浓度具有不同浓度的分析物特异性Ig的生物层。所述至 少一种另外的传感器可被配置为基于样品中祀分析物的存在或不存在产生第=信号。因 此，所述至少一种另外的传感器（例如N个传感器，其中在本发明的某些方面N可W是任何 数字）提供基于各第一、第二和第=信号的相对值定量祀分析物、检测钩状效应的存在和 有效地扩展或增加免疫测定的动态范围的能力。
[0093] 该种方法可被一般化为N个传感器的阵列，其每一个包括不同量或浓度的分析物 特异性抗体并且其可被改造从而具有响应于不同浓度分析物的不同响应曲线。当呈递用于 分析的样品时来自该样的传感器阵列的响应可通过合适的算法用来确定样品中存在的分 析物的浓度范围并且扩大免疫测定的动态范围。任选地，该些传感器的一些可包括相同的 微粒试剂（从而具有对分析物的相同剂量响应）从而允许改善由从相似传感器平均的信号 提供的准确度（N的平方根倒数的平均减少的不确定性）。
[0094] 在一些实施方案中，提供包含N个免疫传感器的免疫传感器装置。N个免疫传感器 的每一个可包括特定于感兴趣的祀分析物的固定抗体的不同负荷或浓度。每个免疫传感器 可被配置为基于固定抗体、祀分析物和标记抗体之间的夹屯、产生信号。在此方法中，免疫传 感器装置提供N个免疫传感器的阵列，其具有对感兴趣的祀分析物的不同的剂量-响应，W 使得使用免疫传感器装置的免疫测定可在广泛范围的浓度上提供分析物的定量从而有效 地扩展的免疫测定的动态范围。
[0095] 根据本发明的一些方面，提供了可鉴定和半定量超范围的结果（例如图4中显示 的那些）的盒。例如如图5中所示，可提供被配置为在约1000至600, 000IU/L的浓度范围 上检测/定量bHCG的测定盒；注意图5中的X-轴不是线性的。bHCG的敏感测量的间隔被 限制在零至约2000IU/L的范围。因此，对于主传感器上从零至大约70nA的信号和减弱的 传感器上从零至大约20nA的信号，读数装置可报告定量bHCG结果给用户。对于来自主传 感器的大于约70nA的信号，读数装置可报告"〉2000IU/mL"。可选择地，对于主传感器上超 过90至lOOnA的信号，读数装置可对于减弱的传感器信号<25nA、<20nA、<15nA和<10nA分 别报告"〉1〇, 〇〇〇IU/L"、"〉50, 000IU/L"、"〉100, 000IU/L"和"〉300, 000IU/L"。指定该些范 围的能力可依赖于从传感器产生的剂量应答曲线的准确性W及制造的整体装置响应不同 浓度bHCG的总体不准确性。
[0096] 然而，本领域技术人员应理解，所有的免疫测定在足够高的分析物浓度下均易受 钩状效应影响，即将存在该样的分析物浓度，在其上两种传感器均经受钩状效应W至两者 均不产生与假阴性结果一致的信号的程度。假定fcig-up在某一点上不受钩状效应的影 响，则钩状效应的存在可借助auP传感器来检测。因此，在本发明的一些实施方案中，该样 的测定的主要动态范围（0-1500IU/LbHCG)、auP传感器的信号损失可用于定量或半定量较 高浓度的bHCG。
[0097]在优选的实施方案中，bHCG的微粒试剂和bHCG的减弱的微粒试剂可使用W下方 法来制造。此外，W两种水平涂覆抗-bHCG的微粒试剂可通过类似的方法来制备。首先通 过离屯、对微粒（例如由BangsL油oratoriesInc.或SeradynMicroparticlesInc.提供 的駿化物修饰的乳液微粒（CMu巧）进行缓冲液交换，随后加入Ig，其运行被动吸附在微粒 上。随后可用抑6. 2的2-(N-吗咐代）己横酸（MES缓冲液）中碳二亚胺巧DAC)活化颗 粒上的駿基基团，W与抗体形成酷胺键。随后通过离屯、除去任何小珠聚集物，并将完成的小 珠冷冻保存在核实的稳定基质例如乳糖醇/DEAE-葡聚糖中。在可选择的实施方案中，CMuP 可用邸AC预活化并随后与Ig反应。如上所述，减弱的试剂的涂层覆盖度可仅为旨在用于 主传感器的微粒试剂的完全覆盖度的大约2%或上文提供的其它覆盖度范围。
[0098] 为了将微粒试剂结合至传感器对（例如主免疫传感器和减弱的免疫传感器），将 包含去离子水中约1%的固体（即微粒和/或减弱的微粒）的约0. 4nL的微滴微分散（例 如使用美国专利No. 5, 554, 339的方法和装置，其在此通过引用W整体并入本文）在主免疫 传感器和/或减弱的免疫传感器的表面上或覆盖主免疫传感器和/或减弱的免疫传感器的 光图案化PVA选择性渗透层上。随后使微滴干燥。干燥微粒颗粒与多孔层的附着显著阻止 微粒在样品（例如血液或尿液样品）或洗漆流体中的溶解。然而，在一些实施方案中，可使 用另外的偶联化学来确保多孔层和/或免疫传感器上的小珠固定。该样的技术是本领域公 知的。
[0099]用于钩状效麻檢测的見外的或替代的系统巧试剂
[0100] 在本发明的优选实施方案中，可将两种捕获试剂用于检测样品中可引起钩状效应 的高浓度的祀抗原。第一试剂可包含正常或"完全"浓度的抗原结合试剂例如分析物特异 性Ig或抗体，并且第二试剂可包括显著更低或"减弱"的浓度的抗原结合试剂。根据本发明 的该些方面，由该两种试剂的每一种捕获的祀抗原的量应单独测量。在优选的实施方案中， 捕获抗体可附着至单独的微粒制剂，其中一种为完全涂覆浓度并且另一种为如本文所讨论 的减弱的浓度。所述微粒随后可打印在两种单独的电极传感器（例如主传感器和减弱的传 感器）上。祀抗原与该些微粒的每一种的结合可使用抗体-碱性磯酸酶缀合物来检测。所 述两种微粒的每一种上结合至祀抗原的缀合物的量通过测量从碱性磯酸酶的作用产生的 电流通过在每种单独的电极上测量此来单独地检测。
[0101] 本领域技术人员应