利用dapi嵌入和释放模拟dna纳米折纸结构作为药物载体的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于DNA纳米技术发展、纳米材料功能化及应用领域，涉及一种通过DNA滚环扩增技术以及DNA折纸术构建的DNA纳米折纸结构，同时利用有DNA双链结合特性以及细胞膜穿透特性的荧光染料DAPI对DNA纳米折纸结构进行标记跟踪，实现实时监控以及模拟DNA纳米折纸复合结构作为药物载体的载药、缓释过程，也可作为一种新的荧光定量分析方法应用于生物分子检测，如肿瘤的早期检测、术后监测评估以及细胞成像等领域。
【背景技术】
[0002]近年来，恶性肿瘤已成为全球范围内严重危害人类健康及生命的重大疾病之一。调查数据显示，在发展中国家，癌症的死亡率在所有疾病的死亡率中位居第二位。世界各国投入大量的人力、物力用于肿瘤的预防、诊断和治疗。近年来快速发展的纳米生物技术，为目前抗肿瘤药物载体领域提供了强有力的手段。纳米材料作为新一代的药物载体的研究正蓬勃发展，它本身能改善药物的水溶性、提高药物的稳定性以及实现药物缓慢控制释放、靶向定位、以及多靶向治疗等。目前利用纳米颗粒或纳米结构作为抗肿瘤药物载体进行抗肿瘤的研究中，使用较多的如高分子纳米材料、脂质体以及金属纳米粒子等，并且已有很多纳米药物运载系统成功应用的先例，但不可否认的是，在药物的高效负载、靶向输运、集治疗和检测于一体的多功能药物载体的研究里关于仍然存在诸多问题，比如脂质体的粒径分布可能影响载体进入细胞的效率，另外一些金属纳米粒子存在生物安全方面的争议等。因此，近几年国际上基于DNA纳米技术的DNA纳米折纸结构成为新一代的抗肿瘤药物载体的相关研究备受瞩目。
[0003]DNA折纸术作为一种精确高效的自组装技术，自2006年Rothemund发明以来在生物医药、高灵敏度检测、纳米光电子器件、等离子体光子学领域展现出巨大的应用潜力，近年来受到广泛关注。而目前进行DNA折纸时，多利用含7249个碱基的噬菌体单链M13 DNA作为脚手架链，同时需设计几百条几个碱基不等的特定序列单链DNA作为订书钉链，然后再通过特定的折纸程序，进行不同二维纳米结构的组装。在这过程中，实验设计和操作复杂，订购试剂耗资昂贵。
【发明内容】
[0004]为克服现有技术的不足，本发明提供一种利用DAPI嵌入和释放模拟DNA纳米折纸结构作为药物载体的方法。
[0005]—种利用DAPI嵌入和释放模拟DNA纳米折纸结构作为药物载体的方法，其特征在于，通过DNA滚环扩增技术得到长单链DNA作为支架链，加入订书钉链后进行折纸得到二维DNA纳米折纸结构，具备DNA双链强力结合能力的荧光染料嵌入其中，通过嵌入后荧光强度的增高以及DNA纳米折纸复合结构降解后染料释放导致荧光强度下降过程监控DNA纳米折纸结构的稳定性并模拟其作为抗肿瘤药物载体的药物负载及缓释过程。
[0006]所述的DNA滚环扩增技术，环模板为一碱基数为96的闭合单链DNA，且序列为:5’ -TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCT GACTTC-3’。
[0007]所述的订书钉链共三条，每条都能与长单链DNA进行互补杂交，且序列分别为，订书钉链 1:5’ -CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’ ；订书钉链 2: CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG ;订书钉链 3: TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT。
[0008]所述的支架链加入订书钉链后得到二维DNA纳米折纸结构，制备条件是:高温95°C，三分钟，后每降0.2°C，持续20s，直至4°C。
[0009]所述的二维DNA纳米折纸结构，长度可达微米级，宽度为16nm。
[0010]所述的具备DNA双链强结合能力的荧光染料，嵌入双链之前荧光微弱，而嵌入后则荧光值大大增强，且能穿透细胞膜的4’，6_ 二脒基-2-苯基吲哚(4，, 6-diamidino-2-phenyI indole, DAPI)0
[0011 ] 所述的DNA纳米折纸复合结构与DAPI形成的复合结构或通过电纺技术所得的DNA纳米折纸结构膜与DAPI形成的复合结构。
[0012]本发明通过DNA滚环扩增技术使得短链DNA延伸成长单链DNA，后将其作为脚手架链，加入三条订书钉即可通过DNA折纸术制备具有一定宽度的DNA纳米折纸结构。因此纳米折纸结构由双链结构组成，因此可结合有双链强力嵌入特性的荧光染料DAPI(4，，6-diamidino_2-phenylindole，4’，6- 二脒基 ~2~ 苯基卩引噪)。通过 DAPI 嵌入 DNA 纳米折纸结构后荧光强度的增强以及DNA纳米折纸结构降解后释放DAPI导致的荧光强度下降模拟DNA纳米折纸结构作为抗肿瘤药物载体的药物负载及缓释过程。
【附图说明】
[0013]图1:不同浓度DAPI溶液中加入与不加入DNA纳米折纸结构两组荧光值高低比较结果。由结果可以看出，加入DNA纳米折纸结构的实验组荧光值有明显的增强。
【具体实施方式】
[0014]实施例1:
16 μ L 引物 DNA (I μ Μ，序列为 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3，)中依次加入 12 μ L 环 DNA(2 μΜ，序列为:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L，10 mM)，RCA buffer (4 μ L，10Χ)，phi29 polymerase 4 μ L，10 U/μ L)，混合溶液终体积为 40 μ L。然后 30° C 水浴中扩增30 mino所得产物40 μ L经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3 μ LdPAmilliQA 12 μ L，加入订书链1-3(100 μ Μ，序列依次为:
5 ’ -CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’
5 ’ -CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’
5’ -TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’)各 I μ L，2 μ L TAE 缓冲液(10 X，125mMMg2+)，总体积为20 μ L，溶液充分混合均匀后置入高温95° C后梯度降温至25° C。1yL产物稀释到90 μ LMill1-Q水中，取5 yL滴到平整清洁云母表面，吸附3min后，Mill1-Q滴流冲洗，原子力显微镜Tapping-mode成像。
[0015]实施例2:
16 μ L 引物 DNA (I μ Μ，序列为 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3，)中依次加入 12 μ L 环 DNA(2 μΜ，序列为:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L，10 mM)，RCA buffer (4 μ L，10Χ)，phi29 polymerase 4 μ L，10 U/μ L)，混合溶液终体积为 40 μ L。然后 30° C 水浴中扩增30 mino所得产物40 μ L经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3 yL，加入milliQ水12 yL，加入订书链1-3 (I μΜ,序列依次为:
5 ’ CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3’
5 ’ CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3’
5 ’ TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3，，各 I μ L，2 μ L TAE 缓冲液(10 X，125mMMg2+)，总体积为20 μ L，溶液充分混合均匀后置入高温95° C后梯度降温至25° C。取10 μ L制备的DNA纳米折纸结构，加入10 μ L 0.5mg/mL DAPI溶液后室温下反应1min后加入80 μ LmiIIiQ水后混合均匀，使用荧光分光光度计(激发波长/发射波长:364nm/454nm)测试其荧光强度；同时取20 μ L 0.5mg/mL DAPI溶液后并加入80 μ LmilliQ水后混合均匀，使用荧光分光光度计(激发波长/发射波长:340nm/488nm )测试溶液荧光强度，比较两组荧光强度大小判断DAPI嵌入DNA纳米折纸结构后荧光增强效果。
[0016]实施例3:
16 μ L 引物 DNA (I μ Μ，序列为 5’ CCAGCCTAAGAGTTGAGCA3，)中依次加入 12 μ L 环 DNA(2 μΜ，序列为:5，TATGCCCAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGCACAATGGTCGGATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTATTCTCAACTCGTCTCTGCCCTGACTTC3’)，dNTPs (4 μ L，10 mM)，RCA buffer (4 μ L，10Χ)，phi29 polymerase 4 μ L，10 U/μ L)，混合溶液终体积为 40 μ L。然后 30° C 水浴中扩增30 mino所得产物40 μ L经过10%PAGE电泳，后割胶回收，去除小片段DNA及多余的环DNA及引物DNA。取回收所得产物3 yL，加入milliQ水12 yL，加入订书链1-3 (I μΜ,序列依次为:
5 ’ CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC3’
5 ’ CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG3’
5 ’ TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT3，，各 I μ L，2