一种针对高分子纳米材料的透射电镜简易检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于纳米技术领域，特别涉及一种针对高分子纳米胶束采用生物透射电镜的简易检测方法。
【背景技术】
[0002]对于高分子纳米胶束材料而言，透射电子显微镜观察是直观检测其形貌的重要手段。采用透射电镜观察胶束最早出现在1988年，研究者利用快速冷冻透射电子显微镜方法(cryo-TEM)，使用特制的样品台以避免样品溶液在制备过程中蒸发，采用液态乙烷作为传热介质使薄层样品快速凝固，在低温状态下观察到了胶束的存在，首次为胶束研究提供了直观的证据。
[0003]迄今为止，利用透射电镜观察胶束已经得到较为广泛的应用和发展，为能拍到清晰的胶束图像，在准备电镜样品时通常需要历经复杂的制备过程，如:纯化胶束后进行固定、脱水、包埋，而后可采用超薄切片、冷冻超薄切片、冷冻蚀刻等方法处理样品并观察；也有研究者将胶束溶液通过气流从毛细管中喷射出来雾化，用表面附有支持膜的铜网接住散落的胶束粒子；或者将有支持膜的铜网在胶束溶液中浸润后冷冻干燥再进行电镜观察。这些方法耗时长，工序多，样品制备过程复杂。
[0004]—般来说，透射电子显微镜按照加速电压分为高电压透射电子显微镜和低电压透射电子显微镜。
[0005]高压电镜通常指加速电压在200kV以上的透射电镜，电子束穿透力强，提高了分辨率，检测如金颗粒等高电子密度的纳米颗粒时易得到高质量图像，但主要由碳、氢、氧等轻元素组成的高分子散射电子能力较弱，如样品未按照常规固定、脱水、包埋的电镜制样方法，只经过快速简易处理即在高压电镜下观察，容易使样品损伤及反差减弱。120kV电子显微镜具有低加速电压，增强了电子束与样品的作用强度，能提升快速简易处理样品的图像衬度和对比度，同时电镜样品不易损伤及变形。
[0006]此外，目前较为清晰的胶束透射电镜图像胶束粒径多在50nm以上，在利用现有技术检测50nm以下的高分子胶束时仍然有很大的局限性。
【发明内容】
[0007]针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种针对高分子纳米材料尤其是胶束的简易、快速的生物透射电镜检测方法。本发明提供的方法以高分子纳米材料检测技术为基础，通过生物技术与高分子材料、化学的结合，能够显著提高50nm及以下尺寸的纳米材料电镜图像的质量，有利于进一步拓展生物透射电镜作为一种高分子纳米材料直接观测手段的应用。
[0008]本发明的检测方法中电镜样品制备简单，能够获得清晰及完美的图像，且所观察胶束的粒径可以在50nm以下，对于小尺寸高分子纳米颗粒的直观检测具有重要的推动作用，对高分子纳米材料在微观下的形态观察提供了新的技术手段，拓展了高分子纳米材料的研究领域。
[0009]为达上述目的，本发明采用如下技术方案:
[0010]一种针对高分子纳米材料的检测方法，包括如下步骤:
[0011]I)以两亲性高分子材料和药物为原料，通过溶剂挥发法制备包载药物的高分子纳米胶束，得到胶束水溶液，用于下一步制样及检测；
[0012]2)将步骤I)得到的胶束水溶液稀释后取微量滴加于附有支持膜的铜网上，烘烤，如将放有铜网的表面皿置于烘片台上，使水分蒸发完全；对样品进行染色，然后用去离子水洗涤，洗涤完成后再次将样品完全烘干得到高分子纳米胶束；
[0013]3)将步骤2)制得的高分子纳米胶束电镜样品利用生物透射电子显微镜进行形貌观测，设置适用于高分子材料的加速电压及适当的放大倍数。
[0014]经上述步骤后，可得到粒径小于50nm的高分子胶束透射电镜图像。该图像与传统材料型透射电镜观测的50nm以下胶束图像相比，清晰度显著提高，纳米颗粒与衬底对比度明显增加。同时，该检测方法简单快速，避免了冷冻、切片等复杂的制样过程，大大简化了高分子纳米材料的电镜检测工艺，且解决了 50nm以下尺寸高分子纳米材料电镜图像模糊的问题。
[0015]作为优选，步骤I)中所述高分子材料通常为具有两亲性的高分子材料中的一种或两种以上的混合物，如不同分子量的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物-聚乙二醇(PLGA-PEG)、聚己内酯-聚乙二醇(PCL-PEG)等中的I种或2种以上的混合，优选为PEG2000的DSPE-PEG高分子材料。适用于本发明的两亲性高分子材料需能通过组装形成纳米胶束，从而才能利用透射电镜通过本方法进行检测。
[0016]优选地，所述药物通常为含氟类药物，优选为氟比洛芬和/或氟比洛芬酯，进一步优选为氟比洛芬。
[0017]优选地，溶剂挥发法所选溶剂通常为甲醇、丙酮、四氢呋喃中的一种或两种以上的混合物，优选为三者的混合物。
[0018]优选地，溶剂挥发法通常采用机械搅拌或磁力搅拌，优选为磁力搅拌。
[0019]优选地，溶剂挥发法的搅拌速度通常为每分钟600-1200转，优选为每分钟800-1000转；搅拌时间通常为5-48h，优选为8_12小时。
[0020]作为优选，步骤2)中所述稀释后的胶束水溶液中高分子材料的浓度为0.1?5mg/mL，优选为 0.5 ?lmg/mL0
[0021]优选地，所述支持膜可采用F0RMVAR膜、普通碳支持膜、纯碳膜或薄纯碳膜，优选为纯碳膜。
[0022]优选地，所述烘烤的温度通常为25_40°C，优选为30-35°C。
[0023]优选地，所述染色使用染液试剂，优选为I %?5%的醋酸双氧铀水溶液，进一步优选为2%的醋酸双氧铀水溶液。
[0024]优选地，所述染色试剂用量为6-10 μ L0
[0025]优选地，所述染色的方法可以为将铜网置于染液液滴上；也可以直接滴加染液于铜网，优选为直接滴加染液于铜网。
[0026]优选地，所述染色的时间通常为2-20分钟，优选为5-10分钟。
[0027]优选地，所述洗涤的次数通常为2-10次，优选为3-5次。
[0028]作为优选，步骤3)中生物透射电子显微镜的电压设置通常为80_120kV，优选为80kVo
[0029]本发明提供了一种新的检测途径，所采用的生物透射电镜目前观察的主要对象包括生物组织超微结构(如噬菌体、大肠杆菌、肿胀的线粒体)、纳米药物作用肿瘤细胞亚显微结构(如结肠癌细胞、细胞里的金纳米棒)、纳米材料的生物效应(如金纳米棒与DNA整合作用)等。本发明在生物透射电镜通用范围的基础上，拓展了高分子纳米材料利用生物透射电镜检测的应用，拓宽了生物透射电镜用于材料检测的选择范围。
[0030]本发明的检测方法简易、快速。在提高了 50nm以下高分子纳米胶束透射电镜图像质量的同时，简化了高分子纳米材料电镜样品制备的过程，减少了中间环节的影响，实现了简便、快速制样，而且针对涉及到的高分子材料选择了合适的染液试剂，达到了高质量成像的目的。
【附图说明】
[0031]图1为实施例1的电镜图像(左:bar = 500nm ;右:bar = 200nm)；
[0032]图2为实施例2的电镜图像(左:bar = 200nm ;右:bar = 10nm)；
[0033]图3为实施例3的电镜图像(左:bar = 200nm ;右:bar = 10nm)；
[0034]图4为实施例4的电镜图像(左:bar = 500nm ;右:bar = 200nm)；
[0035]图5为实施例5的电镜图像(左:bar = 200nm ;右:bar = 10nm)。
【具体实施方式】
[0036]为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅用于帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
[0037]实施例1
[0038](I)称取10mgDSPE-PEG2k粉末和Img氟比洛芬粉末，各自溶解于0.5mL四氢呋喃后将两者混匀，逐滴加入ImL水中，同时进行搅拌，搅拌速度为每分钟800转；12小时后得到待测的载药胶束水溶液；
[0039](2)将该溶