br>[0099] 本实验对实施例1中所得到的发酵乳消化产物进行了超高效液相色谱-质谱分 析。图1为消化产物的液相色谱图，根据实验的前处理方法，共得到1374种低分子量化合 物，证实了经本实验室的瑞士乳杆菌发酵得到的酸奶中物质的复杂性以及质谱检测器优越 的灵敏度和分离性。
[0100] 本实验在UPLC-MS分析前，对发酵乳进行胃肠道消化模拟实验，因此最终得到的 多肽序列对消化酶有良好的耐受性，在一定程度上能抵抗其水解作用，有更大进入机体发 挥其作用的潜在可能。
[0101] 2. 2氨基酸序列质量的匹对
[0102] 以a sl_酪蛋白（ID :1087,变体B)为例，通过程序匹对，得到来源于该蛋白质序列 的预测多肽序列共55条，具体序列见表1。
[0103] 表 1
[0107] 2. 3多肽序列的验证
[0108] 本方法将预测得到的多肽序列经Biolynx验证，最终得到牛乳蛋白来源多肽共 119条。其中，a sl-酪蛋白、as2-酪蛋白、β-酪蛋白、K-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球 蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白来源的多肽序列分别为8，5，21，7，5，11，44，18条，具体分布见 表2。由表2可知，得到的多肽大多为3~6个氨基酸残基。经胃消化模拟模拟实验后鉴定 得到的多肽序列，多为低分子量的小肽，具有易被吸收的特点。Sadat-Mekmene L等人研究 发现，细胞膜上有可运输寡肽的转运体，主要运输3~6个氨基酸残基的多肽，使多肽进入 细胞质发挥其活性作用，同时需要ATP水解提供能量。
[0109] 表2多肽的分布情况
[0111] 需要说明的是：a sl-酪蛋白（a sl-CN)、a s2-酪蛋白（a sl-CN)、β -酪蛋白 (β-CN)、κ-酪蛋白（κ-CN)、α-乳白蛋白（α-LA)、β-乳球蛋白（β-LG)、乳铁蛋白 (LAC)、血清白蛋白（ALB);有些可来源于多条牛乳蛋白的多肽，先记录在前一条蛋白上。
[0112] 以a sl_酪蛋白（ID :1087,变体Β)为例，根据本文方法对预测得到序列逐一分析， 得到asl-酪蛋白来源的多肽序列共8条，具体如表3所示。如质核比为615. 37Da的物质， 出峰时间为6. 63min，程序推测序列为LEQLL，提取质荷比为615. 37Da的质量色谱图及其一 级质谱图，如图2所示，将其质谱图导入Biolynx，由图3、4可知，根据az，by断裂的情况， 发现该有6个碎片离子峰与LEQLL的实际二级质谱图相吻合，经过Biolynx软件分析计算， 质荷比615. 37Da的序列片段证实为LEQLL，与asl-酪蛋白的95-99残基序列对应。再如， 质荷比为544. 38Da的序列物质，程序推测序列为RLKK，提取质荷比为544. 38Da的质量色谱 图及其一级质谱图，如图5所示。同理，根据az，by断裂的情况以及图6、7,未发现与RLKK 实际断裂相吻合的碎片离子峰，经过Biolynx软件分析计算，可证实质荷比544. 38Da的序 列片段不为RLKK。
[0113] 表3α sl-酪蛋白来源多肽的鉴定
[0114?
[0115] 其中，实验中证实存在的GS和SG具有较高的抑制血管紧张素转化酶活性，研究测 定其IC 5。分别为3800和8500 μ M。Jose Angel Gomez-Ruiz等人研究了多种西班牙奶酪， 具体筛选了分子量〈l〇〇〇Da的混合物，并用HPLC-MS/MS和离线MS/MS具体分析其中成分， 从一种Cabrales奶酪中分离得到了多肽MPL，并研究了其抑制血管紧张素转化酶活性，发 现活性不显著。此外，鉴定得到的其它a sl-酪蛋白来源多肽序列也分别有被报道过。
[0116] 除Cisl-酪蛋白来源外，还有大量经验证具有生物活性的、其它乳蛋白来源多肽， 如具有ACE抑制活性的FPIIV，来源于β -酪蛋白的第205-209位残基；具有抗菌活性的 KKISQ，来源于as2-酪蛋白的第180-184位残基等等。此外，通过本实验建立的方法，还获 得了一系列新的多肽序列。
[0117] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及 其功效，而并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也 应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情 况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本 发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的 更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种鉴别发酵乳中生物活性多肽的方法，具体包括如下步骤： 1) 多肽的粗提：取发酵乳进行低温离心分离，取上清液； 2) 多肽的纯化： a. 对步骤1)的上清液进行超滤处理，收集滤液； b. 固相萃取柱分离：收集的滤液采用Waters Sep-pak C18固相萃取柱萃取，收集生物 活性多肽混合物； 3) 多肽的消化及稳定性：采用两步酶解法酶解步骤2)的生物活性多肽混合物，第一步 酶解所采用的酶为胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶为胰酶； 4) 将步骤3)得到的产物进行超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱UPLC-MS联用分 析，得到生物活性多肽的相对分子量； 5) 建立牛奶来源蛋白氨基酸序列数据库； 6) 将步骤4)中UPLC-MS分析得到的相对分子质量，在牛奶来源蛋白氨基酸序列数据库 中进行搜索，得到预测多肽序列； 7) 验证生物活性多肽的序列：将步骤6)中所得预测多肽序列的理论二级质谱图与 UPLC-MS得到的实际二级质谱图对比分析，通过二级质谱图中的离子碎片峰的匹配情况，确 认预测多肽序列是否正确。2. 如权利要求1的方法，其特征在于，步骤1)所述发酵乳为瑞士乳杆菌发酵乳。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述瑞士乳杆菌发酵乳为将瑞士乳杆菌添 加到脱脂乳中进行厌氧发酵而获得；所述厌氧发酵的条件为：发酵温度36~38°C，发酵时 间6~8h。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述低温离心的条件为：4°C， 8000 ~lOOOOrpm，离心 15 ~30min。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2) a所述超滤处理所采用的是截留分子 量分别为3kDa的超滤管；所述超滤处理过程中，转速为4800r/min，时间为30min，离心温度 为 4。。。6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)b中，固相萃取柱分离，具体方法为： 活化和平衡Waters S印-pak C18固相萃取柱；将步骤2) a中收集的滤液进行稀释后上样， 采用洗脱液洗脱，收集所得到的洗脱液，即包含生物活性多肽混合物。7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)b中，固相萃取柱分离法中，所采用 的洗脱液为甲醇和CldH2O的混合液，所述甲醇和CldH 2O的混合液中甲醇与CldH2O的体积比为 80:20,所述甲醇和CldH2O的混合液中含有0.1% (v/v)的甲酸。8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述两步酶解法为：将步骤2)得 到的含有多肽的混合物溶于灭菌去离子水中，并加入胃蛋白酶，获得反应液，调节反应液PH 值为1. 9~2. 1，在36. 5~38. 5°C的恒温水浴中保温反应60~120min，获得第一步酶解 液；将第一步酶解液的PH值调整为7. 4~7. 6,并加入胰酶，于36. 5~38. 5°C的恒温水浴 中保温反应120~180min，获得第二步酶解液；将第二步酶解液置于95~100°C水浴中加 热使酶失活，获得酶解产物；酶解产物冷冻干燥获得产品。9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4)所述胃蛋白酶的添加量为胃蛋白 酶10~30mg/g底物；所述胰酶的添加量为胰酶30~50mg/g底物。10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)具体实现的方法为：将UPLC-MS 得到的相对分子质量，与已建立的牛奶来源蛋白氨基酸序列数据库中氨基酸序列对应的相 对分子量匹对，得到相对分子质量误差在±0.0 lDa内的生物活性多肽的序列、该序列的相 对分子质量以及该序列的具体蛋白来源，以此作为预测多肽序列。11. 如权利要求1~10任一权利要求所述的方法在发酵乳生物活性多肽鉴别中的应 用。
【专利摘要】本发明提供了一种鉴别发酵乳中生物活性多肽的方法，对发酵乳进行了有效的前处理后，进行胃肠道消化模拟实验，保证尽可能多的得到发酵乳中及其消化产物中的生物活性多肽，特别是浓度低、但具有生物活性的多肽，并且得到的多肽序列一定程度上具有抵抗水解的作用，更利于人体吸收并发挥其生物活性。同时，还建立了一种通过分子量匹配得到预测序列，再通过计算验证预测得到的多肽序列方法。通过这种方法鉴定得到牛奶蛋白来源多肽共119条，除大量已经被报道过的生物活性肽外，还得到了大量未被前人报道过的多肽。该方法能普遍用于复杂基质中生物活性肽的分析鉴定，比如发酵乳及其消化产物。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN105044222
【申请号】CN201410809351
【发明人】张少辉, 徐宇, 徐海红, 钱蕙佶, 胡亚菁, 金赢凯
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2014年12月19日