具有内部校准的测定的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请是2013年3月15日提交的美国申请号13/833,365的继续申请，该美国申 请为了所有目的通过引用而全文并入本文。
技术领域
[0003] 本文提供了用于具有内部校准的测定的试剂盒和方法。
【背景技术】
[0004] 在过去几十年中，已经使用荧光、化学发光或响应于分析物产生信号的其他手段 进行了测定。目前，许多测定通过测量在反应混合物的总体积中产生的光信号的强度来进 行。产生的光信号可以通过光学手段来测量，其中产生的光信号由大量分子发出。在典型 的实施方案中，这些测定可以如下进行：将怀疑含有抗原的样品与包含附接至固体支持物 (例如，微粒）上的第一抗体的试剂组合，以形成反应混合物。该抗原如果存在于样品中， 则与该第一抗体特异性结合。向反应混合物中引入包含其上附接有标记的第二抗体的偶联 物，并与所述抗原特异性结合，该抗原与第一抗体特异性结合，该第一抗体如前所述附接至 固体支持物上。这样的测定被称为夹心测定或免疫计量测定。这种类型的测定示意性地示 于图1中。通常在通过进行洗涤步骤从反应混合物中除去未结合的偶联物之后，测量由标 记物引起的信号。测量来源于反应混合物的总体积的信号，然后将其与校准曲线进行比较， 以确定样品中存在的抗原的浓度。
[0005] 当测定不包括从未结合的样品分析物中分离结合的样品分析物时，其被认为是 '一步'测定。当测定包括从未结合的样品分析物中分离结合的样品分析物时，其通常被认 为是'两步测定'（或延迟的一步测定，这取决于如何进行分离）。
[0006] 在标准的夹心测定中，第一步是使用一组具有已知浓度的分析物校准物生成校准 曲线。然后，使用该校准曲线确定未知样品的浓度。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了用于测定（如免疫测定）的内部校准的试剂盒和方法。本文所提供 的内部校准方法和试剂盒无需制作校准曲线，并允许基于单一内部校准的参考点来确定大 量测试样品中的分析物的存在和/或浓度。
[0008] 因此，在一方面，本发明提供了试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包含：包含第 一标记物的示踪分析物、捕获分析物结合分子和包含第二标记物的检测分析物结合分子， 其中该捕获分析物结合分子和该检测分析物结合分子能够同时与该示踪分析物结合。在不 同的实施方案中，该捕获分析物结合分子附接至固体支持物上。在一些实施方案中，该固体 支持物选自颗粒、微粒、珠子、电极和多孔板。在一些实施方案中，该捕获分析物结合分子和 /或该检测分析物结合分子之一或两者是抗体或其片段。在一些实施方案中，第一标记物和 第二标记物之一或两者是发色团。在一些实施方案中，第一标记物和第二标记物之一或两 者是荧光团。
[0009] 在另一方面，本发明提供了对测定进行内部校准的方法。在一些实施方案中，该测 定包括：
[0010] a)使捕获分析物结合分子与预定浓度的用第一标记物标记的示踪分析物及预定 浓度的用第二标记物标记的检测分析物结合分子接触，其中该捕获分析物结合分子和该检 测分析物结合分子同时与该不踪分析物结合；
[0011] b)测量所获得的第一标记物的信号强度（II。）和第二标记物的信号强度（12。）；
[0012] c)将校正因子（F)确定为第二标记物的强度（12。）与第一标记物的强度（II。）的 比值；由此该校正因子的确定用于对所述测定的内部校准。通常，该方法在不存在测试样品 的情况下进行。
[0013] 在另一方面，本发明提供了确定一个或多个测试样品中的分析物浓度的方法。在 一些实施方案中，该方法包括：
[0014] a)在不存在或存在可能包含测试分析物的一个或多个测试样品的情况下，使捕获 分析物结合分子与预定浓度的用第一标记物标记的示踪分析物及预定浓度的用第二标记 物标记的检测分析物结合分子接触，其中该捕获分析物结合分子和该检测分析物结合分子 同时与该示踪分析物结合，并且如果存在的话，同时与所述一个或多个测试样品中的测试 分析物结合；
[0015] b)测量在不存在所述一个或多个测试样品时获得的第一标记物的信号强度（II。） 和第二标记物的信号强度（12。）；
[0016] C)将校正因子（F)确定为第二标记物的强度（12。）与第一标记物的强度（II。）的 比值；
[0017] d)测量在存在所述一个或多个测试样品时获得的第一标记物的信号强度（Il)和 第二标记物的信号强度（12);以及
[0018] e)通过将第二标记物的强度（12)与第一标记物的强度（Il)的比值除以校正因子 (F)并减去示踪分析物的预定浓度来确定在所述一个或多个测试样品中的测试分析物的浓 度。在不同的实施方案中，步骤b)和d)可以同时或以任意顺序完成。在一些实施方案中， 步骤d)和e)重复一次或多次。在一些实施方案中，步骤a)至c)只进行一次。在一些实 施方案中，示踪分析物的预定浓度的范围为从低于预期的测试分析物浓度至高于预期的目 标测试分析物浓度约5倍。
[0019] 关于内部校准方法和测定分析物浓度的方法的另外的实施方案，在一些实施方案 中，示踪分析物的预定浓度在捕获分析物结合分子的结合容量的饱和度以下。在一些实施 方案中，使用两步测定形式。在一些实施方案中，使用一步测定形式。在不同的实施方案中， 当使用两步测定形式时，检测分析物结合分子的预定浓度等于或超过在第一步中捕获的分 析物和示踪分析物的浓度。在不同的实施方案中，当使用一步测定形式时，检测分析物结合 分子的浓度超过分析物和示踪分析物的浓度。在一些实施方案中，所述方法使用自动化或 半自动化系统来进行。在一些实施方案中，捕获分析物结合分子附接至固体支持物上。在 一些实施方案中，该固体支持物选自颗粒、微粒、珠子、电极和多孔板。在一些实施方案中， 捕获分析物结合分子和/或检测分析物结合分子之一或两者是抗体或其片段。在一些实施 方案中，第一标记物是第一发色团且第二标记物是第二发色团。在一些实施方案中，第一标 记物是第一荧光团且第二标记物是第二荧光团。
【附图说明】
[0020] 图1提供了夹心测定的示意图。
[0021] 图2提供了对使用单一示踪分析物内部校准的测定的实施方案进行说明的示意 图。
[0022] 图3示出了嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL)滴定的流程图。
[0023] 图4示出了使用单一示踪分析物对测定条件变化的内部校正。
【具体实施方式】
[0024] 本公开内容部分地基于使用内部校准物的测定和方法的发现和设计，该内部校准 物可校正测定条件的变化并提高测定精度。此外，通过用单一校准物代替校准物组，可以减 少校准运行的次数，例如，一个校准运行可以确定用于测量大量顺序运行的测试样品的分 析物浓度的准确参数。
[0025] 定义
[0026] 以下术语与本公开内容有关：
[0027] "测定"是测量常常含有物质的复杂混合物的溶液中物质的存在或浓度的生化试 验。在诸如血清或尿的生物液体中的分析物常常使用测定方法进行测定。此类测定是基于 分析物结合分子（例如，抗体或其抗原反应性片段）以高特异性与一种或非常有限的一组 分子结合的独特能力。与分析物结合分子（例如，抗体或其抗原反应性片段）结合的分子 被称为分析物或抗原。需要分离步骤的测定，通常被称为分离测定或非均相测定，是普及 的，因为它们容易设计，但它们经常需要多个步骤，包括对其上结合有标记的试剂的表面的 仔细洗涤。一些测定可以在不进行分离步骤的情况下运行。此类测定常常可通过混合试剂 和样品并进行物理测量来简单地进行。此类测定被称为均相测定，或者较不经常地，被称为 非分离测定。
[0028] 如本文所用的，表述"夹心测定"意指采用两种分析物结合分子同时（例如，在相 同或单独的步骤中）与相同分析物结合的测定。所述分析物结合分子之一直接或间接地 附接至固体支持物上，从而允许分析物直接或间接地附接至该固体支持物，例如，微粒或电 极。其他分析物结合分子直接或间接地附接至标记物，从而允许分析物直接或间接地附接 至该标记物以提供用于检测该分析物的信号。例如，分析物结合分子之一可以是用于与样 品中的分析物（例如，抗原）特异性结合的捕获分析物结合分子（例如，抗体或其抗原反应 性片段），由此该分析物（例如，抗原）直接或间接地附接至固体支持物，例如，电极或微粒， 而其他的分析物结合分子可以是用于与样品中的分析物（例如，抗原）特异性结合的检测 分析物结合分子（例如，抗体或其抗原反应性片段），由此该分析物（例如，抗原）直接或间 接地附接至用于检测抗原的标记物。如果样品中存在相对较高的量的分析物，则将产生较 高的信号。如果样品中存在相对较低的量的分析物，则将产生较低的信号。图1是说明夹 心测定的代表性实例的示意图。
[0029] 如本文所用的，术语"复合物"意指彼此特异性结合的至少两个分子。复合物的实 例包括但不限于，与一个分析物结合分子结合的一个分析物，与多个分析物结合分子结合 的一个分析物，例如，与两个分析物结合分子结合的一个分析物，与多个分析物结合的一个 分析物结合分子，例如，与两个分析物结合的一个分析物结合分子。
[0030] 如本文所用的，表述"固体支持物"意指分析物结合分子（例如，抗体或其抗原反 应性片段）可附接至其上，从而使得该分析物结合分子在液体介质中不能从固体支持物上 脱离的任何固体表面。固体支持物可以容易地与该固体支持物接触的液体分开。在不同的 实施方案中，固体支持物可以是，例如，塑料、衍生塑料、磁性或非磁性金属、玻璃或硅。固体 支持物的代表性实例包括但不限于电极、试管、珠子、微粒、纳米颗粒、微孔或多孔板的孔、 凝胶、胶体、生物细胞、薄片、芯片和本领域普通技术人员所知的其他构造。分析物结合分子 (例如，抗体或其抗原反应性片段）可以附接至其上的物体的一个实例是微粒，例如，磁性 微粒。微粒一般具有小于1000微米的平均直径。微粒可以容易地从其分散于其中的液体 中分离。微粒容易地分散在水性介质中。此外，固体支持物任选地提供回收分析物结合蛋 白质的手段，即，在与进行测定的条件不同的受控条件下从表面上释放或脱离分析物结合 分子的手段。例如，分析物结合分子可借助于可裂解的连接体附接至固体支持物上。
[0031] 如本文所用的，表述"捕获分析物结合分子"意指一种分析物结合分子（例如，抗 体或其抗原反应性片段）：其将分析物，例如，抗原，结合至固体支持物上，其结果是抗体将 该分析物附接至固体支持物上，由此该分析物直接地或通过居间的部分间接地附接至固体 支持物上。
[0032] 如本文所用的，表述"检测分析物结合分子"意指一种分析物结合分子（例如，抗 体或其抗原反应性片段）：其附接至在化学或生物反应中提供或可变成提供可检测的信号 的部分。
[0033] 术语"一步"测定是指不包括从未结合的样品分析物中分离结合的样品分析物的 测定。
[0034] 术语"两步"测定是指包括从未结合的样品分析物中分离结合的样品分析物的测 定。
[0035] "约"是指从所述值大约+/-10%的变化。应当理解，这样的变化总是包含在本文 所提供的任何给定值中，无论是否具体提及。
[0036] 如本文进一步描述的，"分析物"是指待测的化合物或组合物，其可以是配体，其可 以是单表位的或多表位的，抗原的或半抗原的，共享至少一个共同表位位点或受体的单个 或多个化合物。说明性的感兴趣的分析物通常包括但不限于，例如，蛋白质、糖蛋白、肽、多 肽、寡核苷酸或多核苷酸，以及更具体地，例如，抗体、抗原、半抗原、激素、药物、酶或受体。 [0037] "抗体"和"多个抗体"是指单克隆抗体、多特异性抗体、双功能抗体、人抗体、人 源化抗体（完全或部分人源化的）、动物抗体（诸如但不限于鸟（例如鸭或鹅）、鲨鱼、 鲸和哺乳动物，其包括非灵长类（例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚 鼠、猫、狗、大鼠、小鼠等）或非人灵长类（例如、猴、黑猩猩等）、重组抗体、嵌合抗体、单 链Fv( "scFv"）、单链抗体、单域抗体、Fab片段、F(ab'）片段、F(ab'）2片段、二硫键连接 的卩￥(〃8(^￥〃）以及抗独特型（〃3111：；[-1(1〃）抗体、双域抗体、双可变域（0￥0)或三可变域 (TVD)抗体（双可变域免疫球蛋白及其制备方法描述于Wu, C.等人，Nature Biotechnolo gy，25(ll) :1290-1297 (2007)，以及公开号为WO 2001/058956的国际专利申请，其中每一 篇的内容均通过引用并入本文），以及上述任一种的功能活性表位结合片段。尤其是，抗体 包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫反应性片段，即，含有分析物结合位点的分 子。免疫球蛋白分子可以是任何类型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别（例如， IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)或亚类的。为了简单起见，针对分析物的抗体在本文 中常被称为"抗分析物抗体"或仅称"分析物抗体"。如本文所用的术语"双功能抗体"是指 包含对一个抗原位点具有特异性的第一臂和对一个不同的抗原位点具有特异性的第二臂 的抗体，g卩，双功能抗体具有双重特异性。
[0038] "抗体片段"和"多个抗体片段"是指包含抗原结合位点或可变区的完整抗体的一 部分。该部分不包括完整抗体的Fc区的恒定重链域（即，CH2、CH3或CH4,取决于抗体同 种型）。抗体片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F (ab'）2片段、 Fd片段、Fv片段、双抗体、单链Fv(ScFv)分子、只含有一个轻链可变域的单链多肽、含有轻 链可变域的三个CDR的单链多肽、只含有一个重链可变区的重链可变区单链多肽和含有重 链可变区的三个CDR的单链多肽。
[0039] "结合常数"如本文所述。在本文中可互换使用的术语"缔合速率常数"、"kj'或 "k a"是指这样的值：其表示特异性结合对的第一成员（SBPl ;例如，分析物结合分子，抗体 (Ab)或其分析物反应性片段）和特异性结合对的第二成员（SBP2;例如，分析物（例如，抗 原（Ag))的结合速率，或特异性结合对的第一成员与特异性结合对的第二成员之间的复合 物形成的速率，如以下方程式所示：
[0040] SBP1+SBP2 - SBP1-SBP2
[0041] Ab+Ag - Ab-Ag。
[0042] 在本文中可互换使用的术语"解离速率常数"、"krff"或"kd"是指这样的值：其表示 SBPl(例如，分析物结合分子，抗体或其分析物反应性片段）从SBP2(例如，抗原）上的解离 速率，或SBP1-SBP2复合物（例如，抗体-抗原复合物）随时间分离成游离SBPl (例如，分 析物结合分子、抗体或其分析物反应性片段）和SBP2 (例如，抗原）的速率，如以下方程式 所示：
[0043] SBP1+SBP2 - SBP1-SBP2
[0044] Ab+Ag - Ab-Ag
[0045] 用于确定缔合和解离速率常数的方法是本领域公知的。使用基于荧光的技术提 供了高灵敏度和在平衡的生理缓冲液中检测样品的能力。可以使用其他实验方法和仪器 如BlAcore⑨I (生物分子相互作用分析）测定（例如，可从BIAcore International AB， GE Healthcare公司，Uppsala，Sweden获得的仪器）。此外，也可以使用可从Sapidyne Instruments (Boise，Idaho)获得的KinExA? (动力学排除测定）测定。
[0046] 在本文中可互换使用的术语"平衡解离常数"或"KD"是指通过将解离速率（Icciff) 除以缔合速率（U而得到的值。缔合速率、解离速率和平衡解离常数用来表示分析物结合 分子（例如，抗体或其分析物反应性片段）对抗原的结合亲和力。这可由以下反应和方程 式描述：
[0047] A+B - AB
[0049] 这些结合常数中的任何一个，即，ka、kdS K D，可以想象可用来评估或比较"结合亲 和力"，即，结合的倾向或强度。然而，通常如本文所述，结合亲和力是指K D。
[0050] "CDR"在本文中用来指分析物结合分子或抗体可变序列内的"互补性决定区"。 在抗体中，在重链和轻链的每一个可变区中有三个CDR，对于每个可变区，它们被称为 "⑶R1"、"⑶R2"和"⑶R3"。如本文所用的术语"⑶R组"是指在结合抗原的单个可变区中 存在的一组三个CDR。这些⑶R的确切边界根据不同的体系已有不同的定义。Kabat描 述的体系（Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987)和（1991))不仅提供了适用于抗体的任何可 变区的明确的残基编号体系，而且还提供了限定三个CDR的精确的残基边界。这些CDR可被 称为"Kabat CDR"。Chothia 和同事（Chothia 和 Lesk, J.Mol.Biol·，196:901-917(1987); 和Chothia等人，Nature, 342:877-883 (1989))发现Kabat CDR内的某些亚部分采用几 乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性。这些亚部分被称为 " L1"、" L2 "和" L3 "，或"ΗΓ'、"H2 "和"H3 "，其中" L"和"H"分别指代轻链和重链区。这 些区域可以被称为"Chothia⑶R"，它们具有与Kabat⑶R重叠的边界。与Kabat⑶R重 叠的限定 CDR 的其他边界已由 Padlan, FASEB J.，9:133-139 (1995)和]\&1(^31111111，1]\1〇1· Biol.，262 (5) : 732-745 (1996)描述。另外其他的CDR边界限定可能不严格遵循此处的一种 体系，但仍将与KabatCDR重叠，尽管根据特定残基或成组残基乃至整个CDR不显著影响分 析物（例如，抗原）结合的预测或实验发现，它们得以缩短或加长。本文所使用的方法可以 利用根据这些体系中的任意一个限定的⑶R，尽管某些实施方案使用Kabat或Chothia限定 的 CDR0
[0051] "组分"、"多种组分"和"至少一种组分"通常是指捕获抗体、检测或偶联物抗体、校 准物、对照、灵敏度组（panel)、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅助因子、检测试剂、预处 理试剂/溶液、底物（例如，作为溶液）、终止溶液等，根据本文描述的方法和本领域所知的 其他方法，其可包含在用于测定诸如患者血清样品的测试样品的试剂盒中。一些组分可以 在溶液中或被冻干以便重建后在测定中使用。
[0052] 如本文所用的，术语"偶联物"意指包含结合对成员和标记物的实体。
[0053] "对照"是指已知不含分析物（"阴性对照"）或含有分析物（"阳性对照"）的组 合物。阳性对照可以包含已知浓度的分析物。"对照"、"阳性对照"和"校准物"在本文中可 互换使用，其指包含已知浓度的分析物的组合物。"阳性对照"可用来确立测定性能特性，并 且是试剂（例如，分析物）完整性的有用的指示物。
[0054] 在本文中可互换使用的"校正因子"或"F"是指这样的数值，在算术运算中利用该 数值来校正描述由来自检测抗原结合分子的标记物产生的信号的值。尤其是，测量在不存 在测试样品时获得的第一标记物的信号强度（IU和第二标记物的信号强度（12。)，并且将 校正因子（F)确定为第二标记物的强度（12。）与第一标记物的强度（II。）的比值。
[0055] "表位"、"多个表位"或"感兴趣的表位"是指被识别并且可以结合至其特异性结合 配偶体（例如，分析物结合分子，例如，抗体或其片段）上的互补位点的任何分析物上的位 点。分析物和抗原结合分子是特异性结合对的一部分。例如，表位可以在多肽、蛋白质、半 抗原、碳水化合物抗原（例如但不限于糖脂、糖蛋白或脂多糖）或多糖上。其特异性结合配 偶体可以是，但不限于，分析物结合分子（例如，抗体或其分析物反应性片段）。
[0056] 如本文所使用的，术语"强度"意指每单位面积或体积上电、光、热或声的强度的量 或程度。在不同的实施方案中，术语"强度"是指每单位时间每单位面积计数的光子的数目。 例如，每单位面积1000个光子可以被记录为在单一像素中的500个计数，而每单位面积80 个光子可以被记录为在单一像素中的40个计数。特定的转换取决于所使用的照相系统。强 度与计数的光子数目成比例。
[0057] "标记物"和"可检测标记物"意指直接或间接地附接至