白酶的攻击。骨架也并不单纯由肽、DNA或RNA组成，这意味着该 抗体模拟物在极端的环境条件下是相对稳定的并具有长寿命。另外，由于基于杯芳烃的抗 体模拟物相对较小，因此不太可能产生免疫原性应答。
[0099] Murali 等人（Cell. Mol. Biol. 49(2) :209-216(2003))讨论了一种将抗体缩小为 较小的拟肽的方法，他们将其称作"抗体样结合拟肽"（ABiP)，其也可以用作抗体的替代物。
[0100] Silverman 等人（Nat. Biotechnol.，23:1556-1561 (2005))公开了融合蛋白，它是 包含多个结构域的单链多肽，被称为"avimer"。avimer通过体外外显子改组和菌体展示 从人类细胞外受体结构域开发而来，是一类在其对于各种靶分子的亲和力和特异性方面略 微类似于抗体的结合蛋白质。所产生的多域蛋白质可以包含多个独立的结合域，与单表位 结合蛋白质相比，其可表现出提高的亲和力（在有些情况下是亚纳摩尔级的）和特异性。例 如，在美国专利申请公开号 2004-0175756、2005-0048512、2005-0053973、2005-0089932 和 2005-0221384中公开了关于avimer的构建和使用方法的其他细节。
[0101] 通常情况下，可商购的抗体或分析物结合分子可以在本测定中使用。在不同的实 施方案中，例如，使用已知的重组和/或单克隆抗体产生技术产生捕获和检测分析物结合 分子之一或两者。
[0102] 可以按照本领域已知的方法制备和修饰（例如，保守置换）单克隆抗体。修饰的 抗体或其抗原反应性片段检测分析物的能力可使用本领域已知的用于评估抗原结合特异 性的任何标准方法来测定，该方法包括，例如，本文描述和举例说明的方法。这样的方法包 括但不限于酶联免疫吸附测定、Western印迹法、表面等离子体共振（例如，BlAcore?)、 KinExA⑩（动力学排除测定）测定和放射免疫测定。优选地，修饰的抗体或抗原反应性 片段显示出至少与相应的未修饰抗体一样好，并且优选地（甚至期望地）好于相应的未修 饰抗体的分析物结合特性。
[0103] a.合成产牛
[0104] -旦经测序，就可以使用本领域已知的方法，例如，完全固相合成、部分固相合成、 片段缩合和经典的溶液合成，来合成特异性地结合分析物的多肽如单克隆抗体（或其片 段）。参见，例如，Merrifield，J. Am. Chem. Soc. 85:2149(1963)。在固相上，合成一般使用 α -氨基保护的树脂从肽的C-末端开始。例如，合适的起始原料可以通过将所需的α -氨基 酸附接至氯甲基化树脂、羟甲基树脂或二苯甲基胺树脂来制备。一种这样的氯甲基化树脂 由 Bio Rad Laboratories(Richmond，CA)以商品名 BIO-BEADS SX-1 出售，并且 Bodonszky 等人，Chem. Ind. (London) 38:1597(1966)描述了羟甲基树脂的制备。二苯甲基胺（BHA)树 脂已由Pietta和Marshall, Chem. Comm. 650 (1970)描述，并且可作为盐酸盐的形式商购自 Beckmanlnstruments, Inc. (Palo Alto, CA)。如同订购肽一样，自动肽合成仪是可商购的。
[0105] 因此，可以根据由Gisin, Helv. Chim. Acta. 56:1467 (1973)描述的方法，通过借助 于例如碳酸氢铯催化剂将α-氨基保护的氨基酸偶联至氯甲基化树脂来制备多肽。初始偶 联后，通过选择包括三氟乙酸（TFA)或盐酸（HCl)溶液的试剂在室温下在有机溶剂中除去 α -氨基保护基团。
[0106] 合适的α-氨基保护基团包括已知在肽的逐步合成技术中有用的那些基团。 α -氨基保护基团的实例是：酰基型保护基团（例如，甲酰基、三氟乙酰基和乙酰基）、芳香 族氨基甲酸酯型保护基团（例如，苄氧羰基（Cbz)和取代的Cbz)、脂肪族氨基甲酸酯保护基 团（例如，叔丁氧幾基（Boc)、异丙氧幾基和环己氧幾基）和烷基型保护基团（例如，苄基和 三苯基甲基）。Boc和Fmoc是有用的保护基团。侧链保护基团在偶联过程中保持完整并且 在氨基末端保护基团的脱保护过程中或偶联过程中不会分裂开。侧链保护基团必须在完成 最终肽的合成之后并且在不会改变目标肽的反应条件下是可移除的。
[0107] 除去α-氨基保护基团后，剩余的被保护的氨基酸以所需顺序逐步偶联。过量的 每种受保护的氨基酸通常与合适的羧基活化剂如二环己基碳二亚胺（DCC)在溶液中，例 如，在二氯甲烷和二甲基甲酰胺（DMF)混合物中一起使用。
[0108] 在所需氨基酸序列已经完成后，通过用诸如TFA或氟化氢（HF)的试剂处理，从树 脂支持物上解偶所需的肽，该试剂不仅从树脂上切下肽，而且还切下所有剩余的侧链保护 基团。当使用氯甲基化树脂时，氟化氢处理导致游离肽酸的形成。当使用二苯甲基胺树脂 时，HF处理直接产生游离的肽酰胺。或者，当使用氯甲基化树脂时，可以通过用氨处理肽树 脂来解偶侧链保护的肽，以得到所需的侧链保护的酰胺，或用烷基胺处理，以得到侧链保护 的烷基酰胺或二烷基酰胺。然后以通常的方式通过用氟化氢处理除去侧链保护，以得到游 尚酰胺、烷基酰胺或二烷基酰胺。
[0109] 这些和其他的固相肽合成程序是本领域中公知的。这样的程序也由Stewart和 Young 在 Solid Phase Peptide Syntheses(第 2 版，Pierce Chemical Company, 1984)中 描述。
[0110] b.重组产牛
[0111] 特异性结合分析物（或其片段）的多肽如单克隆抗体（或其片段）可以使用本领 域已知的方法重组产生。例如，包含编码抗体（或其片段）的核苷酸序列的分离的核酸可 以在宿主细胞中表达，并且该抗体可以得到分离。分离的核酸包含编码针对分析物的抗体 的氨基酸序列的核苷酸序列。例如，分离的核酸可以用寡核苷酸合成仪来合成。本领域普 通技术人员将容易理解，由于遗传密码的简并性，一个以上的核苷酸序列可以编码给定的 氨基酸序列。就此而言，可以使用编码与针对分析物的抗体的氨基酸序列基本相同的氨基 酸序列的核苷酸序列，条件是所表达的变异抗体与针对分析物的抗体竞争。优选地选择给 定宿主细胞偏好的密码子进行重组产生。可以使用聚合酶链反应（PCR)、连接或连接链反 应（LCR)将编码针对分析物的抗体的氨基酸序列的核苷酸序列与其他核苷酸序列组合，以 编码抗分析物抗体或其抗原反应性片段。单独的寡聚核苷酸通常含有互补组件的5'或3' 突出端。一旦组装，即可将编码抗分析物抗体或其抗原反应性片段的核苷酸序列插入到载 体中，可操作地连接至对于在给定宿主细胞中表达所必需的控制序列，并引入（如通过转 化或转染）到宿主细胞中。核苷酸序列可以进一步操作（例如，连接至编码另外的免疫球 蛋白域如另外的恒定区的一个或多个核苷酸序列）和/或在宿主细胞中表达。
[0112] 虽然不是所有的载体和表达控制序列都可以起到同样好的表达感兴趣的多核苷 酸序列的作用，并且不是所有的宿主都能用相同的表达系统起到同样好的作用，但认为本 领域技术人员将能够在这些载体、表达控制序列、优化的密码子和宿主中作出选择以用于 本公开内容中而无需任何过多的实验。例如，在选择载体方面，必须考虑宿主，因为载体必 须能够在其中复制或能够整合到染色体中。还应考虑载体的拷贝数、控制拷贝数的能力和 由该载体编码的任何其他蛋白质如抗生素标志物的表达。在选择表达控制序列方面，还可 考虑多种因素。这些因素包括但不限于该序列的相对强度、其可控性以及其与编码抗分析 物抗体的核苷酸序列的相容性，特别是在潜在的二级结构方面。应通过考虑以下因素来选 择宿主：它们与所选载体的相容性、它们的密码子使用、其分泌特性、它们正确折叠多肽的 能力、它们的发酵或培养要求、它们使蛋白质糖基化的能力（或其缺乏）以及由核苷酸序列 编码的产物的易纯化性，等等。
[0113] 重组载体可以是自主复制载体，即作为染色体外的实体存在的载体，其复制独立 于染色体复制（如质粒）。或者，载体可以是当引入宿主细胞时被整合到宿主细胞基因组中 并且与它被整合到的染色体一起复制的载体。
[0114] 所述载体优选地是表达载体，其中编码抗分析物抗体的多核苷酸序列可操作地连 接到该多核苷酸序列的转录所需的附加区段。载体通常来源于质粒或病毒DNA。许多用于在 本文提及的宿主细胞中表达的合适的表达载体是可商购的或在文献中描述。对于真核宿主 有用的表达载体包括但不限于包含来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达 控制序列的载体。具体的载体包括pO)NA3· l(+)\Hyg (Invitrogen Corp. ,Carlsbad, CA)和 pCI_neo(Stratagene, La Jolla, CA)。在酵母细胞中使用的表达载体的实例包括但不限于 2 μ质粒及其衍生物、POTl载体（参见，例如，美国专利号4, 931，373)、pJS037载体（描述 于 Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782:202-207 (1996))和 pPICZ A、B 或 C (Invitrogen)。 在昆虫细胞中使用的表达载体的实例包括但不限于PVL941、pBG311(Cate等人，Cell 45:685-698 (1986))和 pBluebac4. 5 以及 pMelbac (这两者均可从 Invitrogen 获得）。
[0115] 可以使用的其他载体允许编码抗分析物抗体的核苷酸序列发生拷贝数扩增。这 类可扩增的载体是本领域中公知的。这些载体包括但不限于那些可以通过二氢叶酸还原 酶（DHFR)扩增（参见，例如，Kaufinan，美国专利号4, 470, 461 ;和Kaufinan等人，Mol. Cell. Biol. 2:1304-1319 (1982))和谷氨酰胺合成酶（GS)扩增（参见，例如，美国专利号 5, 122, 464和欧洲专利申请公开号0338841)而扩增的载体。
[0116] 重组载体可以进一步包含使得该载体能够在所讨论的宿主细胞中复制的核苷酸 序列。在哺乳动物宿主细胞中使用的这种序列的一个实例是SV40复制起点。使载体能够 在酵母细胞中复制的合适的序列是酵母质粒2 μ复制基因REP1-3和复制起点。
[0117] 所述载体还可以包含选择性标记，即，其产物弥补了宿主细胞中的缺陷的基因或 多核苷酸，如编码DHFR的基因或粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)TPI基因（参 见，例如，Russell, Gene 40:125-130 (1985))，或赋予对药物如氨苄青霉素、卡那霉素、四环 素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性的基因。对于丝状真菌，选择性标记包括但不 限于 amdS、pyrG、arcB、niaD 和 sC。
[0118] 载体中还存在"控制序列"，其为对于抗分析物抗体的表达而言必需的或有利的任 何组分。每种控制序列对编码抗分析物抗体的核苷酸序列而言可以是天然的或外来的。这 类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、增强子或上游激 活序列、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括至少一个可操作地连接至编码抗分 析物抗体的多核苷酸序列的启动子。
[0119] 所谓"可操作地连接"是指借助于酶连接或以其他方式，相对于彼此以使得能够行 使序列的正常功能的构型，两个或更多个核苷酸序列的共价连接。例如，编码前序列或分泌 前导序列的核苷酸序列可操作地连接至多肽的核苷酸序列，如果其表达为参与该多肽的分 泌的前蛋白质；启动子或增强子可操作地连接至编码序列，如果其影响该序列的转录；核 糖体结合位点可操作地连接至编码序列，如果其定位成以便促进翻译。通常，"可操作地连 接"意指所连接的核苷酸序列是连续的，并且在分泌性前导序列的情况下，是连续的且在同 一阅读框中。连接通过在方便的限制性位点处连接来完成。如果不存在这样的位点，则可 以同标准重组DNA方法一起使用合成的寡核苷酸衔接子或连接体。
[0120] 在本公开内容的背景下可以使用众多的表达控制序列。这类有用的表达控制序 列包括与上述表达载体的结构基因相关联的表达控制序列以及已知控制原核或真核细胞 或其病毒的基因表达的任何序列及其各种组合。用于在哺乳动物细胞中引导转录的合适 的控制序列的实例包括SV40和腺病毒的早期和晚期启动子，例如，腺病毒2主要晚期启动 子、MT-I (金属硫蛋白基因）启动子、人巨细胞病毒立即早期基因启动子（CMV)、人延伸因子 I a (EF-1 α )启动子、果蝇最小热休克蛋白70启动子、劳斯肉瘤病毒（RSV)启动子、人遍在 蛋白C(UbC)启动子、人生长激素终止子、SV40或腺病毒Elb区聚腺苷酸化信号以及Kozak 共有序列（Kozak, J. Mol. Biol. 196:947-50 (1987)) 〇
[0121] 为了提高在哺乳动物细胞中的表达，可以在编码抗体或其片段的多核苷酸序列的 5'非翻译区插入合成内含子。合成内含子的一个实例是来自质粒pCI-Neo (可从Promega Corporation, Madison, WI获得）的合成内含子。
[0122] 用于在昆虫细胞中引导转录的合适的控制序列的实例包括但不限于多角体蛋白 启动子、PlO启动子、杆状病毒立即早期基因1启动子、杆状病毒39K延迟早期基因启动子 和SV40聚腺苷酸化序列。
[0123] 用于在酵母宿主细胞中使用的合适的控制序列的实例包括酵母α -接合系统的 启动子、酵母磷酸丙糖异构酶（TPI)启动子、来自酵母糖酵解基因或醇脱氢酶基因的启动 子、ADH2-4c启动子和诱导型GAL启动子。
[0124] 用于在丝状真菌宿主细胞中使用的合适的控制序列的实例包括ADH3启动子和终 止子，源自编码米曲霉（Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶磷酸丙糖异构酶或碱性蛋白酶、 黑曲霉（A. niger) α-淀粉酶、黑曲霉或构巢曲霉（A. nidulas)葡糖淀粉酶、构巢曲霉乙酰 胺酶、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂肪酶的基因的启动子，TPIl 终止子，以及ADH3终止子。
[0125] 编码感兴趣的抗体的多核苷酸序列还可以包括或可以不包括编码信号肽的多核 苷酸序列。当抗分析物抗体将从表达它的细胞中分泌时，存在信号肽。如果存在的话，这样 的信号肽应该是被选择用于表达多肽的细胞所识别的信号肽。信号肽可以是与抗分析物单 克隆抗体同源的或异源的，或者可以是与宿主细胞同源的或异源的，即，在正常情况下由该 宿主细胞表达的信号肽或在正常情况下不由该宿主细胞表达的信号肽。因此，信号肽可以 是原核的，例如，来源于细菌，或是真核的，例如，来源于哺乳动物、昆虫、丝状真菌或酵母细 胞。
[0126] 例如，信号肽的存在或不存在将取决于用于产生抗分析物抗体的表达宿主细 胞。为了在丝状真菌中使用，信号肽可以方便地来源于编码曲霉（Aspergillus sp.)淀 粉酶或葡糖淀粉酶的基因、编码米黑根毛霉脂肪酶或蛋白酶或柔毛腐质霉（Humicola lanuginosa)脂肪酶的基因。为了在昆虫细胞中使用，信号肽可以来源于昆虫基因（参 见，例如，国际专利申请公开号WO 90/05783)，如鳞翅目烟草天蛾（Manduca sexta)脂 动激素前体（参见，例如，美国专利号5,023,328)、蜜蜂蜂毒肽（111"廿〇8611)、蜕皮类 固醇 UDP 葡糖基转移酶（egt) (Murphy 等人，Protein Expression and Purification 4:349-357(1993)或人胰脂肪酶（hpl) (Methods in Enzymology 284:262-272(1997))。
[0127] 用于在哺乳动物细胞中使用的信号肽的具体实例包括鼠 IgK轻链信号肽 (Coloma，J. Imm. Methods 152:89-104(1992))。用于在酵母细胞中使用的合适的信号肽包 括来自酿酒酵母的α-因子信号肽（参见，例如，美国专利号4, 870, 008)、小鼠唾液淀粉酶 的信号肽（参见，例如，Hagenbuchle等人，Nature 289:643-646 (1981))、经修饰的羧肽酶 信号肽（参见，例如，Valls等人，Cell 48:887-897(1987))、酵母BARl信号肽（参见，例 如，国际专利申请公开号WO 87/02670)和酵母天冬氨酸蛋白酶3 (YAP3)信号肽（参见，例 如，Egel-Mitani 等人，Yeast 6:127-137(1990)) 〇
[0128] 任何合适的宿主可以用于产生抗分析物抗体，包括细菌、真菌（包括酵母）、植 物、昆虫、哺乳动物或其他合适的动物细胞或细胞系，以及转基因动物或植物。细菌宿主 细胞的实例包括但不限于革兰氏阳性细菌，如芽孢杆菌属（Bacillus)的菌株，例如，短 芽孢杆菌（B. brevis)或枯草芽孢杆菌（B.subtilis)，假单胞菌属（Pseudomonas)或链 霉菌属（Streptomyces)的菌株，或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌（E. coli)菌株。例如， 通过原生质体转化（参见，例如，Chang 等人，Molec. Gen. Genet. 168:111-115 (1979))、 使用感受态细胞（参见，例如，Young等人，J. of Bacteriology 81:823-829 (1961)，或 Dubnau 等人，J. of Molec. Biol. 56:209-221 (1971))、电穿孔（参见，例如，Shigekawa 等人，Biotechniques 6:742-751 (1988))或接合（参见，例如，Koehler 等人，J. of Bacteriology 169:5771-5278 (1987))，能够实现载体向细菌宿主细胞内的引入。
[0129] 合适的丝状真菌宿主细胞的实例包括但不限于曲霉属的菌株，例如，米曲霉、黑曲 霉或构巢曲霉，镰孢属（Fusarium)或木霉属（Trichoderma)的菌株。可以使用本领域技 术人员已知的技术，通过包括原生质体形成、原生质体转化以及细胞壁再生的方法转化真 菌细胞。用于转化曲霉属宿主细胞的合适的程序在欧洲专利申请公开号238023和美国 专利号5, 679, 543中描述。用于转化镰孢属的种的合适的方法由Malardier等人和国际 专利申请公开号WO 96/00787描述。可使用由Becker和Guarente,于Abelson, J.N. and Simon, Μ. I. , editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology 194:182-187, Academic Press, Inc.，New York ; Ito 等人，J. of Bacteriology 153:163(1983);以及 Hinnen 等人，PNAS USA 75:1920(1978)所述的程序转化酵母。
[0130] 合适的酵母宿主细胞的实例包括酵母属的菌株，例如，酿酒酵母（S. cerevisiae)， 裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)，克鲁维酵母属（Klyveromyces)，毕赤酵母属 (Pichia)如巴斯德毕赤酵母（P.pastoris)或甲醇毕赤酵母（P.methanolica)，汉逊 酵母属（Hansenula)如多形汉逊酵母（H. polymorpha)，或耶氏酵母属（yarrowia) 的菌株。用异源多核苷酸转化酵母细胞以及从中产生异源多肽的方法由Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, USA (在 Yeastmaker?酵母转化系统试剂盒（Yeast Tranformation System Kit)的产品方案中）和Reeves等人，FEMS Microbiology Letters 99:193-198 (1992)，Manivasakam 等人，Nucleic Acids Research 21:4414-4415(1993)以 及 Ganev 等人，FEMS Microbiology Letters 121:159-164(1994)披露。
[0131] 合适的昆虫宿主细胞的实例包括但不限于鳞翅目（L印idoptora)细胞系，如草地 贪夜蛾（Spodoptera frugiperda) (Sf9 或 Sf21)或粉纹夜蛾（Trichoplusia ni)细胞（High Five)(参见，例如，美国专利号5, 077, 214)。昆虫细胞的转化和