分析物结合分子（例如，抗 体或其分析物反应性片段）或分析物上以使分析物结合分子（例如，抗体或其分析物反应 性片段）与分析物之间的反应变得可检测的部分，并且如此标记的分析物结合分子（例如， 抗体或其分析物反应性片段）或分析物被称为"可检测地标记的"。标记物可以产生例如 通过视觉或仪器手段可检测的信号。在此方面，标记物可以是任何信号生成部分。如本文 所用的，标记物（或信号生成部分）产生可测量的信号，该信号通过外部手段是可检测的， 例如，通过电磁辐射进行测量，并且根据所使用的系统，信号水平可以变化到该标记物是在 诸如电极、微粒或珠子等固体支持物的环境中的程度。各种标记物包括信号产生物质，如酶 (辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、碱性过氧化物酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等），发色团或色原 (例如，吸收在紫外或可见光区的光的染料、磷光体、荧光剂、荧光团（例如，荧光蛋白（绿 色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白）；藻胆素（藻红蛋白、R-藻红蛋 白、B-藻红蛋白）；咕吨衍生物（荧光素、罗丹明、俄勒闪绿（Oregon green)、曙红、德克萨 斯红（Texas red));花青衍生物（花青、Cy染料、吲噪羰花青、氧杂羰花青、硫杂羰花青、部 花青）；萘衍生物（丹酰和氟硅酸钠衍生物）；香豆素衍生物；噁二唑衍生物（吡啶噁唑、硝 基苯并噁二唑、苯并噁二唑）；芘衍生物（级联蓝（cascade blue));噁嗪衍生物（尼罗红 (Nile red)、尼罗蓝（Nile blue)、甲酚紫、噁嗪170);吖啶衍生物（原黄素、叮啶橙、吖啶 黄）；芳基次甲基（arylmethine)衍生物（金胺、结晶紫、孔雀石绿）；四P比略衍生物（卟吩、 酞菁、胆红素）），发光团，化学发光化合物，放射性化合物等）。标记物的代表性实例包括产 生光的部分，例如，叮啶鐵化合物，以及产生焚光的部分，例如，焚光素。其他标记物在本文 中描述。在此方面，所述部分本身可能不是可检测的，但当与另一部分反应时可能变为可检 测的。例如，可以使用酶来产生信号或放大信号或前述两者兼具。作为另一实例，所述部分 可以是所谓的猝灭剂或被猝灭剂作用的实体。术语"可检测标记物"的使用旨在包括这类 标记的这些和其他手段。
[0058] "患者"和"受试者"可以互换使用，是指动物，如鸟（例如鸭或鹅）、鲨鱼、鲸和哺 乳动物，包括非灵长类（例如，牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、 大鼠和小鼠）和灵长类（例如，猴、黑猩猩和人）。优选地，患者或受试者是人，如怀疑具有、 诊断为具有分析物缺乏或分析物的存在或过量或经历对此的预防性或治疗性处理的人。
[0059] "患者样品"、"测试样品"和"样品"在本文中可以互换使用。样品，如尿、血清、血 浆、羊水、脑脊髓液、胎盘细胞或组织、内皮细胞、白细胞或单核细胞，可以按从患者处获得 时那样直接使用，或者可进行预处理，例如，通过过滤、蒸馏、提取、浓缩、离心、灭活干扰组 分、添加试剂等，从而以本文讨论的某种方式或以本领域已知的其他方式来改变样品的特 性。在本公开内容的语境中，样品优选为血清或血浆，最优选为血清。
[0060] 如在本文所述的诊断测定中所用的，"预处理试剂"，例如，裂解、沉淀和/或增溶试 剂，是裂解存在于测试样品中的任何细胞和/或增溶存在于测试样品中的任何分析物的试 剂。如本文进一步描述的，预处理对于所有样品不都是必需的。除其他方面外，增溶分析物 需要从存在于样品中的任何内源结合蛋白质中释放分析物。预处理试剂可以是均相的（不 需要分离步骤）或非均相的（需要分离步骤）。使用非均相预处理试剂时，在进行测定的下 一个步骤之前要先从测试样品中移除任何沉淀的分析物结合蛋白质。预处理试剂任选地可 以包含：(a) -种或多种溶剂和盐，（b) -种或多种溶剂、盐和去污剂，（c)去污剂，（d)去污 剂和盐，或（e)适合于细胞裂解和/或分析物增溶的任何试剂或试剂组合。
[0061] 在本文所述的测定和试剂盒的语境中，"质量控制试剂"包括但不限于校准物、对 照和灵敏度组。一般使用"校准物"或"标准"（例如，一个或多个，如多个）以便建立校准 (标准）曲线以用于分析物如抗体或分析物的浓度的内插。或者，可以使用接近预定的阳 性/阴性截止值的单一校准物。可以结合使用多个校准物（即，多于一个校准物或变化量 的校准物），以便包含"灵敏度组"。
[0062] "特异性结合配偶体"是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两个不同的分 子，它们通过化学或物理方式彼此特异性结合。因此，除了共同测定的分析物/分析物结合 分子和抗原/抗体特异性结合对之外，其他的特异性结合对可以包括生物素和抗生物素蛋 白（或链霉抗生物素蛋白）、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应物和受体分子、辅 因子和酶、酶和酶抑制剂等。此外，特异性结合对可包括作为原始特异性结合成员的类似物 的成员，例如，分析物-类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，包 括单克隆和多克隆抗体以及复合物及其片段，无论是分离的还是重组产生的。
[0063] 在特异性结合对的成员（例如，抗原（或其片段）和抗体（或其抗原反应性片段）） 之间的相互作用的语境中，"特异性的"和"特异性"是指该相互作用的选择反应性。词语"特 异性结合"和类似词语是指特异性结合对的第一成员（例如，抗体或其抗原反应性片段）与 特异性结合对的第二成员（例如，抗原）结合，而不与其他抗原（或其片段）特异性结合的 能力。在本公开内容的语境中，与分析物特异性结合的抗体被认为对分析物是特异性的。 [0064] "示踪剂"是指附接至标记物的分析物或分析物片段，其中附接至标记物的分析物 可以有效地与分析物竞争对分析物特异性的分析物结合分子上的位点。
[0065] 提供上述术语是为了描述特定实施方案的目的。所述术语并非意在限制。
[0066] 1.简介
[0067] 本文提供的内部校准物试剂盒和测定方法尤其适用于夹心测定形式。用单一示踪 剂（即，附接至标记物或报告分子的示踪分析物）代替校准物组。预定浓度的相同示踪剂也 被添加进每个测试样品中作为内部校准物。采用示踪分析物允许仅使用单一内部校准物， 该单一内部校准物可用于确定和分析一个或多个数据集。例如，内部校准物可以一天运行 或测定一次并用于分析随后的读数，可以每周运行一次并用于分析随后的读数，或者可以 每月运行一次并用于分析随后的读数。在设定的一段时间内是否需要再次运行或测定校准 物取决于该测定的条件和情况，并且对于普通技术人员来说将是显而易见的。然而，本公开 内容提供的是用单一内部校准物代替一组校准物，使得不需要运行校准曲线。因此，这种方 法的好处至少有两方面：首先，产生经校准的测定所需的测定运行的次数减少；第二，内部 校准物可以适应并校正测定条件的变化，这转而提高了测定精度。
[0068]用单一示踪分析物代替整组校准物简化了校准程序，并减少了试剂的使用和测定 性能时间。单一示踪分析物还用作内部校准物。通常，单一示踪分析物与样品预混合，并形 成三联体（tripartite) "夹心"复合物，该复合物同测试分析物竞争的同时与捕获和检测 分析物分子结合。结合的示踪分析物的信号强度反映了测定条件（例如，基质、温度、反应 时间、微粒损失、试剂稳定性等）的任何变化。结合的示踪分析物与结合的检测分析物结合 分子的信号强度比自动校正反应条件的变化。
[0069] 本文所描述的测定和方法无需使用多种外部校准物或无需制作校准曲线。内部校 准物反映了测定条件的变化，因此降低了对仪器精度和试剂稳定性的要求。内部校准物的 使用进一步减少或消除了对校准曲线稳定性的顾虑。
[0070] 通常，对于使用标记的示踪分析物作为内部校准物，在饱和浓度的检测分析物结 合分子的存在下测量预定浓度的示踪分析物的信号强度，然后针对在怀疑含有测试分析物 的测试样品的存在下获得的强度值，估算标记的示踪分析物的信号强度的测量值。以这种 方式，提供了单点校准值，其可用于确定大量顺序评估的测试样品的分析物浓度。
[0071] 在用于生成单点校准值的特定实施方案中，所述方法包括：
[0072] a)使捕获分析物结合分子与预定浓度的用第一标记物标记的示踪分析物及预定 浓度的用第二标记物标记的检测分析物结合分子接触，其中该捕获分析物结合分子和该检 测分析物结合分子同时与该不踪分析物结合；
[0073] b)测量所获得的第一标记物的信号强度（II。）和第二标记物的信号强度（12。）；
[0074] c)将校正因子（F)确定为第二标记物的强度（12。）与第一标记物的强度（II。）的 比值；
[0076] 本文还提供了确定一个或多个测试样品中的分析物的浓度的方法。在一个实施方 案中，该方法包括：
[0077] a)在不存在或存在可能包含测试分析物的一个或多个测试样品的情况下，使捕获 分析物结合分子与预定浓度的用第一标记物标记的示踪分析物及预定浓度的用第二标记 物标记的检测分析物结合分子接触，其中该捕获分析物结合分子和该检测分析物结合分子 同时与该示踪分析物结合，并且如果存在的话，同时与所述一个或多个测试样品中的测试 分析物结合；
[0078] b)测量在不存在所述一个或多个测试样品时获得的第一标记物的信号强度（II。） 和第二标记物的信号强度（12。）；
[0079] c)将校正因子（F)确定为第二标记物的强度（12。）与第一标记物的强度（II。）的 比值；
[0080] d)测量在存在所述一个或多个测试样品时获得的第一标记物的信号强度（Il)和 第二标记物的信号强度（12);以及
[0081] e)通过将第二标记物的强度（12)与第一标记物的强度（Il)的比值除以校正因子 (F)并减去示踪分析物的预定浓度来确定在所述一个或多个测试样品中的测试分析物的浓 度。
[0082]
[0083] 采用上述方法，可以使用单一校准值评价大量测试样品（例如，约2至约200, 000 个、约2至约20, 000个、约2至约2000个、约2至约200个或约2至约20个）而不需要生 成校准曲线。
[0084] 2.示踪分析物
[0085] 在不同的实施方案中，用作内部校准物的示踪分析物是感兴趣的分析物或其片段 或模拟物，它可以在夹心测定中与捕获分析物结合分子和检测分析物结合分子形成复合 物。在适当时，如本文所述及本领域中已知的，蛋白质分析物可以从天然来源中纯化或通过 重组或合成手段产生。非蛋白质分析物可以通过本领域技术人员已知的化学和合成（包括 生物合成）手段来产生。示踪分析物可以直接或间接地附接至标记物。
[0086] 如本文所述，标记物可以是任何可检测的标记物。说明性的标记物包括，例如，荧 光团、放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白标记物、发色团、化学发光标记物等。可以使 用如本领域已知的任何合适的可检测标记物。例如，可检测标记物可以是放射性标记物 (如 3H、125I、35S、14C、32P和 33P)，酶标记物（例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、碱性过氧化 物酶、葡萄糖6-磷酸脱氢酶等），化学发光标记物（例如吖啶酯、硫酯或磺酰胺；鲁米诺、 异鲁米诺、菲啶鑰酯等），一种或多种发色团，例如，在紫外或可见光区发光的一种或多种染 料，磷光体，荧光剂，荧光团（例如，荧光蛋白（绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋 白、青色荧光蛋白）；藻胆素（藻红蛋白、R-藻红蛋白、B-藻红蛋白）；咕吨衍生物（荧光素、 罗丹明、俄勒冈绿、曙红、德克萨斯红）；花青衍生物（花青、Cy染料、吲哚羰花青、氧杂羰花 青、硫杂羰花青、部花青）；萘衍生物（丹酰和氟硅酸钠衍生物）；香豆素衍生物；噁二唑衍 生物（吡啶噁唑、硝基苯并噁二唑、苯并噁二唑）；芘衍生物（级联蓝）；噁嗪衍生物（尼罗 红、尼罗蓝、甲酚紫、噁嗪170);吖啶衍生物（原黄素、叮啶橙、吖啶黄）；芳基次甲基衍生物 (金胺、结晶紫、孔雀石绿）；四吡咯衍生物（卟吩、酞菁、胆红素）），发光团，化学发光剂，荧 光标记物（例如，荧光素（例如，5-荧光素、6-羧基荧光素、3'6-羧基荧光素、5 (6)-羧基荧 光素、6-六氯荧光素、6-四氯荧光素、异硫氰酸荧光素等）），罗丹明，量子点（例如，硫化锌 加帽的硒化镉），温度测量标记物，或免疫-聚合酶链反应标记物。在不同的实施方案中，示 踪分析物用藻胆素（例如，藻红蛋白、R-藻红蛋白、B-藻红蛋白）进行标记。在一些实施方 案中，示踪分析物用吖啶鑰化合物，例如，叮啶-9-羧酰胺、至少一种吖啶-9-羧酸芳基酯或 其任意组合进行标记。
[0087] 3.分析物
[0088] 本文所提供的试剂盒和方法对于检测任何感兴趣的分析物是有用的。说明性的感 兴趣的分析物通常包括但不限于，例如，蛋白质、肽、多肽、寡核苷酸或多核苷酸，以及更具 体地，例如，抗体、抗原、半抗原、激素、药物、酶或受体。在适当时，可商购的分析物结合分子 (例如，抗体或其抗原反应性片段）可以在现在描述的试剂盒和测定中使用，或者分析物结 合分子（例如，抗体或其抗原反应性片段）可以使用本领域中已知的方法来产生。通常，使 用本文所述的试剂盒和方法检测的分析物可以通过夹心测定来检测。
[0089] 使用本发明试剂盒和测定方法检测的说明性的感兴趣的分析物包括但不限于，例 如，细胞因子、免疫抑制药物、心血管疾病抗原、癌抗原、传染病抗原、药物剂、激素、血浆、血 清和/或血液抗原、生物标志物（例如，肾损伤的生物标志物）、维生素和自身免疫抗原。这 样的分析物包括但不限于，例如：细胞因子、免疫抑制药物（例如，西罗莫司、他克莫司、依 维莫司、坦罗莫司（temsorolimus)、唑罗莫司、环孢菌素或任何这些化合物的类似物）；心 血管疾病抗原（例如，肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白I (cTnl)、血清肌酸激酶MB同工酶（CKMB)、 碱性或B型利尿钠肽（BNP)、半乳糖凝集素3、髓过氧化物酶（MPO)、肌红蛋白、D-二聚体 纤维蛋白降解产物（或FDP)、高灵敏度C反应蛋白）；癌抗原（例如，前列腺特异性抗原 (PSA)、甲胎蛋白（AFP)、CA 125、CA 15-3、CA 19-9、癌胚抗原（CEA)、细胞角蛋白19、细胞 角蛋白片段21-1 (CYFRA21-1)、人附睾蛋白4 (HE4)、前胃泌素释放肽（ProGRP)、鳞状细胞 癌抗原（SCC-Ag));传染病抗原（例如，巨细胞病毒（CMV) IgG、CMV IgM、风疹IgG抗体、风 疹IgM、弓形虫IgG、弓形虫IgM、甲型肝炎病毒（HAV)IgG、HAV IgM、乙型肝炎病毒核心蛋白 (HBc)、HBc IgM、乙型肝炎表面抗原（HBsAg)、乙型肝炎e抗原（HBeAg)、丙型肝炎病毒（HCV、 人类免疫缺陷病毒（HIV))、美洲锥虫病（Chagas)、EB病毒（EBV)、梅毒、人嗜T淋巴细胞病 毒（HTLV)、抗链球菌溶血素O(ASO));药物剂（例如，对乙酰氨基酚、苯丙胺/甲基苯丙胺、 巴比妥酸盐、苯并二氮杂罩、大麻酚、可卡因、迷幻药（Ecstasy)、乙醇、美沙酮、阿片剂、苯 环利定（PCP)、丙氧芬、水杨酸盐、三环类抗抑郁药、阿米卡星、卡马西平、洋地黄毒苷、地高 辛、庆大霉素、锂、苯巴比妥、苯妥英、奎尼丁、茶碱、妥布霉素、丙戊酸、万古霉素）；激素（例 如，硫酸脱氢表雄酮（DHEA-S)、雌二醇、卵泡刺激激素（FSH)、人绒毛膜促性腺素（hCG)、促 黄体激素（LH)、孕酮、催乳素、性激素结合球蛋白（SHBG)、睾酮、皮质醇、胰岛素、胃蛋白酶 原I、胃蛋白酶原II、C-肽、甲状旁腺激素（PTH)、甲状腺激素T3、甲状腺激素T4、促甲状腺 激素）、酶（例如，酸性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、淀粉酶、天冬氨酸氨基转移 酶、肌酸激酶、γ -谷氨酰转移酶（GGT)、乳酸脱氢酶（LDH)、α羟丁酸脱氢酶（a HBDH)、月旨 肪酶、胆碱酯酶、血浆铜蓝蛋白）；血浆、血清和/或血液抗原（例如，白蛋白、微量白蛋白、 前白蛋白、肌酸酐、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、胆红素、脂蛋白（a) [Lp(a)]、低密度脂蛋白 (LDL)、高密度脂蛋白（HDL)、载脂蛋白AU载脂蛋白B、补体C3、补体C4、触珠蛋白、免疫球 蛋白A(IgA)、免疫球蛋白E(IgE)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、κ轻链、λ轻 链、β 2微球蛋白、血红蛋白、高半胱氨酸、C反应蛋白（CRP));生物标志物（例如，肾损伤的 生物标志物，例如，嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL));维生素（例如，维生素 Β12、叶酸、维生素D);抗环瓜氨酸肽（抗CCP)抗体、α -1抗胰蛋白酶（AAT)、α -1糖蛋白、 自身免疫抗原（例如，类风湿因子（RF)、抗甲状腺球蛋白（抗Tg)和抗甲状腺过氧化物酶抗 体（抗TPO抗体））。
[0090] 4.分析物结合分子
[0091] 通常，本文所述的试剂盒和测定采用两种分析物结合分子，其中分析物结合分子 与分析物和/或示踪分析物复合。与分析物和/或示踪分析物复合的两种分析物结合分子 可以以相同或不同的亲和力结合分析物，例如，与分析物结合的亲和力有约3倍至约5倍、 约5倍至约100倍、约5倍至约10倍、约10倍至约25倍、约25倍至约50倍、约50倍至约 100倍、约3倍、约5倍、约10倍、约25倍、约50倍、约100倍或更多倍的差异。在不同的实 施方案中，所述分析物结合分子之一或两者直接或间接地与标记物结合。在不同的实施方 案中，所述分析物结合分子之一或两者是抗体或其抗原反应性片段（即，结合分析物）。
[0092] 在一些实施方案中，捕获和检测分析物结合分子之一或两者是非抗体分析物结合 分子。已开发了以类似于抗体的方式针对并结合靶标的其他化合物。这些"抗体模拟物"中 的一些使用非免疫球蛋白骨架作为替代的蛋白质框架用于抗体的可变区。
[0093] 例如，Ladner等人（美国专利号5, 260, 203)描述了单多肽链结合分子，其具有类 似于聚集的、但在分子上分离的抗体轻链和重链可变区的结合特异性。该单链结合分子含 有通过肽连接体连接的抗体重链和轻链可变区两者的抗原结合位点，并将折叠成类似于两 肽抗体的结构。该单链结合分子相对于常规抗体显示出几个优点，包括更小的尺寸、更高的 稳定性且更易于修饰。
[0094] Ku 等人（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (14) :6552-6556 (1995))公开了 基于细 胞色素b562的抗体替代物。Ku等人（1995)生成了一个文库，其中对细胞色素b562的两个 环进行随机化并针对与牛血清白蛋白的结合进行选择。个别突变体被发现与抗BSA抗体类 似地与BSA选择性结合。
[0095] Lipovsek等人（美国专利号6, 818, 418和7, 115, 396)公开了一种以纤连蛋白或 纤连蛋白样蛋白质骨架和至少一个可变环为特征的抗体模拟物。这些基于纤连蛋白的抗体 模拟物被称为Adnectins，表现出天然或工程化抗体的许多相同的特性，包括对于任何目标 分析物的高亲和力和特异性。用于开发新的或改进的结合蛋白质的任何技术可与这些抗体 模拟物一起使用。
[0096] 这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构类似于IgG重链的可变区的结构。因此， 这些模拟物表现出与天然抗体在性质和亲和力方面相似的抗原结合性质。另外，这些基于 纤连蛋白的抗体模拟物表现出超过抗体和抗体片段的某些好处。例如，这些抗体模拟物的 天然折叠稳定性不依赖于二硫键，因此，在通常会分解抗体的条件下是稳定的。此外，由于 这些基于纤连蛋白的抗体模拟物的结构类似于IgG重链，因此环随机化和改组过程可以在 体外使用，该过程类似于抗体在体内的亲和力成熟的过程。
[0097] Beste 等人（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96 (5) : 1898-1903 (1999))公开 了一种 基于脂质运载蛋白骨架的抗体模拟物(Amiealinc?)。脂质运载蛋白由在蛋白质的末端具 有四个高变环的β桶状结构组成。Beste (1999)对环进行随机诱变并针对与例如荧光素的 结合进行选择。三种变体表现出与荧光素特异性结合，其中一种变体显示出与抗荧光素抗 体类似的结合。进一步的分析表明，所有随机化位置都是可变的，表明Anticalin?将适合 用作抗体的替代物。Anticalins?是单链小肽，通常为16〇至iso个残基，其提供了相对于 抗体的若干优点，包括生产成本降低、储存稳定性增加和免疫反应降低。
[0098] Hamilton等人（美国专利号5, 770, 380)公开了一种合成抗体模拟物，其使用与用 作结合位点的多个可变肽环连接的杯芳烃的刚性非肽有机骨架。肽环相对于彼此均从杯芳 烃的几何学上的同一侧伸出。由于这种几何学确认，所有环均可用于结合，从而提高了与分 析物的结合亲和力。然而，与其他抗体模拟物相比，基于杯芳烃的抗体模拟物并非完全由肽 组成，因此，它较不易受蛋