均 数。从检测分析物结合分子的标记物测量的信号的量决定了分析物的浓度。
[0196] 为了进行会提供更高灵敏度的测量，可使用可商购获得的落射荧光显微镜来通 过支撑它们的透明表面对复合物进行成像。这样的显微镜的代表性实例是与高分辨率 C⑶相机（例如，Hamamatsu C4742-80-12AG型）耦接的机动化倒置荧光显微镜（例如， OLYMPUS "1X81"），其可从许多来源商购获得。
[0197] 在这种更高灵敏度的测量中，使用双色方法来提供比采用来自反应混合物总体 积的光信号的传统测定和通过先前描述的单色方法进行的测量都更高的灵敏度。这种更 高的灵敏度通过相对于在传统测定或使用单色方法的测定中用作校准曲线的线性图的斜 率，在较低浓度下具有更大的斜率的线性函数图来证明。为实施本方法，改动可商购的仪 器以增加用于检测用第一标记物标识的第一三联体复合物的第二检测通道，和用于检测用 第二标记物标识的第二三联体复合物的第二通道。荧光通道用包含激发滤光器和发射滤 光器的一组滤光器来限定，其允许具有特定波长的光到达样品并且具有特定波长的光到 达CCD相机。例如，荧光团PE仅可在PE通道中检测到，而不能在任何其他荧光通道中检 测到。类似地，荧光团Cy5仅可在Cy5通道中检测到，而不能在任何其他荧光通道中检测 到。可以容易地改动从而包含第二检测通道的代表性自动化和半自动化系统包括，例如， ARCHITECT1:、AxSYMK、IMx1' PRiSMK、EIA(珠子）、Quantum? II 和 Abbott 照护点（i-STAT?，Abbott Laboratories)。
[0198] 承载捕获分析物结合分子的微粒、附接到荧光团的检测分析物结合分子和怀疑含 有分析物的样品在合适的条件下组合以进行测定。在进行测定后，忽略不是从以下复合物 发出的任何荧光信号：该复合物包含附接至捕获分析物结合分子的微粒、分析物和包含附 接至第一荧光团的检测分析物结合分子的偶联物。接下来，获得捕获分析物结合分子的图 像（其特征在于与第一荧光团不同的第二荧光团）。该图像忽略与没有以均匀的方式用捕 获分析物结合分子包被的任何微粒相对应的任何像素。如果微粒没有被均匀包被，则忽略 来自该部分的像素。然后，基于偶联物发射的荧光进一步定量该复合物。此后一步骤忽略 复合物上没有达到选择标准的任何部分。选择标准的典型实例是均匀的涂层，该涂层基本 上消除可能由高度非特异性结合导致的偶联物的过度聚集。如前所述，选择标准根据特定 的测定而变化。最后，测量合格颗粒的每个像素的强度平均值，以便将强度与建立分析物浓 度的校准曲线进行比较。
[0199] 在另一个实施方案中，获得样品的白光图像。采用该白光图像来确定微粒的位置。 该步骤不是必需的，但是有用的，因为可能希望定位每个固体支持物例如微粒的位置。然后 获得第一荧光图像以确定附接到微粒上的捕获分析物结合分子的位置。第一荧光图像使用 颜色，例如，红色、绿色。获得第二荧光图像以确定作为偶联物的组分存在的分析物结合分 子的位置。第二荧光图像使用颜色，例如，红色、绿色，但第二荧光图像的颜色与第一荧光图 像的颜色不同。选择来源于微粒上的捕获分析物结合分子和偶联物上的分析物结合分子两 者的像素用于进一步分析。计算每个像素的计数，并且记录每个像素的计数的平均值和标 准偏差。从分析中忽略计数大于或小于例如计算的标准偏差的两倍的像素。计算剩余像素 的每个像素的计数的平均数。从检测分析物结合分子的标记物测量的信号的量决定了分析 物的浓度。
[0200] 7.试剂盒和方法针对特定仪器的改动
[0201] 可以改变试剂盒（或其组分），以及通过如本文所述的测定确定测试样品中分 析物浓度的方法，以在多种自动化和半自动化系统（包括其中固体支持物包含电极或微 粒的那些系统）中使用。仅作为示例包括以下的改动。说明性的自动化和半自动化系统 例如在美国专利号5, 089, 424和5, 006, 309中描述，并且是商业销售的，例如，由Abbott Laboratories (Abbott Park, IL)作为 ARCHITECT丧销售。
[0202] 自动化或半自动化系统与非自动化系统（例如，ELISA)相比的一些区别包括捕 获分析物结合分子（例如，捕获分析物结合分子，例如，抗体或其抗原反应性片段）所附接 的基底（其可影响夹心结构形成和分析物反应性），以及捕获、检测和/或任何任选的洗 涤步骤的长度和时机。非自动化形式如ELISA可能需要相对较长的与样品和捕获试剂的 温育时间（例如，约2小时），而自动化或半自动化形式（例如，ARCHITFJTT 1', Abbott Laboratories)可能具有相对较短的温育时间（例如，对于▲RCHlTECT't 18分钟）。 类似地，非自动化形式如ELISA可能温育检测分析物结合分子（例如，检测分析物结合分 子，例如，抗体或其抗原反应性片段）如偶联物试剂相对较长的温育时间（例如，约2小 时），而自动化或半自动化形式（例如，ARCHITECT8)可能具有相对较短的温育时间 (例如，对于ARCHITECT^约4分钟）。
[0203] 可从Abbott Laboratories获得的其他平台包括但不限于AxSYM^JMx?1 (参见，例如，美国专利号5, 294, 404,其通过引用全文并入本文）、PRISM?、KIA (珠子） 和Quantum? II以及其他平台。此外，测定、试剂盒和试剂盒组分可以以其他形式使用，例 如，在电化学或其他手持式或照护点测定系统上使用。例如，本公开内容适用于进行夹心 测定的商业Abbott照护点（i-STAT' Abbott Laboratories)电化学测定系统。在单 次使用测试装置中的免疫传感器及其制造和操作方法例如在美国专利号5, 063, 081、美国 专利申请公开号2003/0170881、美国专利申请公开号2004/0018577、美国专利申请公开号 2005/0054078和美国专利申请公开号2006/0160164中描述，这些文献由于其有关教导而 通过引用全文并入本文。
[0204] 特别地，对于测定针对丨_statr系统的改动，下面的配置是有用的。制造了具有 一对金电流测量工作电极和银-氯化银参比电极的微制造硅芯片。在一个工作电极上，具 有固定的捕获分析物结合分子的聚苯乙烯珠子（〇.2mm直径）附着到电极上的图案化聚乙 烯醇的聚合物涂层上。在典型的丨-STAT?测定中，其他电极用涂覆有抗人血清白蛋白或 不与感兴趣的分析物结合的另一种蛋白质的参比珠子或微粒涂覆。将该芯片组装到具有适 合测定的流体形式的丨-STAT?筒匣中。在该筒匣的样品保持室的壁的一部分上，有包含用 碱性磷酸酶（或其他标记物）标记的检测分析物结合分子的层。在该筒匣的流体袋内是包 含对氨基苯酚磷酸的水性试剂。
[0205] 在操作时，将含有分析物的样品加入到测试筒匣的保持室内，并且将筒匣插入到 I-Stat"读取器中。在检测分析物结合分子（例如，检测分析物结合分子，例如，抗体或 其抗原反应性片段）已经溶解到样品中后，筒匣内的栗组件迫使样品进入含有芯片的导管 中。在其中对其进行振荡以促进在捕获分析物结合分子、分析物和标记的检测分析物结合 分子之间形成夹心结构。在测定的倒数第二个步骤中，将流体从袋中压出并进入导管，以从 芯片上洗下样品并进入废料室中。在测定的最后一个步骤中，碱性磷酸酶标记物与对氨基 苯酚磷酸反应，以裂解磷酸基团并允许释放的对氨基苯酚在工作电极处被电化学氧化。基 于测量的电流，读取器能够借助于内置的算法和出厂设定的校准曲线计算样品中的分析物 的量。
[0206] 进一步不言而喻，本文所述的方法和试剂盒必然包括用于进行测定的其他试剂和 方法。例如，包括多种缓冲液，如本领域已知的和/或可容易制备的，或优化以用于例如洗 涤的，作为偶联物稀释剂和/或作为校准稀释剂的缓冲液。示例性的偶联物稀释剂是在某 些试剂盒（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)中使用的，并含有2-(N_吗啉代）乙横 酸（MES)、盐、蛋白质阻断剂、抗微生物剂和去污剂的ARCHITEClT偶联物稀释剂。示例 性的校准物稀释剂是在某些试剂盒（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)中使用的，包 含含有MES的缓冲液、其他盐、蛋白质阻断齐lj、抗微生物剂的人校准物稀 释剂。此外，如2008年12月31日提交的美国专利申请号61/142, 048中描述的，可以获得 改善的信号生成，例如，以I-STATgi筒匣形式，使用连接到信号或检测分析物结合分子的 核酸序列作为信号放大器。
[0207] 通常，为了与本发明的试剂盒和方法一起使用，改动了自动化和半自动化系统以 使用两个不同的通道分析样品，第一通道用于检测用第一标记物标识的第一三联体复合 物，而第二通道用于检测用第二标记物标识的第二三联体复合物。
[0208] 通常，本发明的试剂盒和方法可用于任何目的，例如，用于诊断、预测或评估患者 的治疗性/预防性处理的功效，以及其他用途。
[0209] 实施例
[0210] 以下实施例用于说明本公开内容。这些实施例并非旨在以任何方式限定所请求保 护的发明。
[0211] 实施例1
[0212] 嗜中性粒细胞明Jj父酶相关脂质运载蛋白（NGAL)的滴定
[0213] 本实施例使用代表性分析物NGAL证明了采用单一示踪分析物作为内部校准物的 功能性和有效性。
[0214] 这些研究使用由ATCC登录号为PTA-8024的鼠杂交瘤细胞系1-2322-455产生的 抗体（以下称为"mAb2322"）和由ATCC登录号为PTA-8026的鼠杂交瘤细胞系1-903-430 产生的抗体（以下称为"mAb903"）来完成。鼠杂交瘤细胞系1-903-430和1-2322-455 分别于2006年11月21日保藏在美国模式培养物保藏中心（American Type Culture Collection)(以下称为 "ATCC"），10801University Blvd·，Manassas, VA. 20110-2209。细 胞系1-903-430被分配了 ATCC登录号PTA8026。细胞系1-2322-455被分配了 ATCC登录 号PTA-8024。微粒用抗NGAL抗体mAb2322包被。抗NGAL鼠单克隆抗体和重组人NGAL如 以前发表的那样产生并纯化（Olejniczak, E. T.，Ruan, Q.，Ziemann, R. N.，Birkenmeyer, L. G.，Saldana, S. C.和 Tetin, S. Υ· Biopolymers (2010) 93 (7) : 657-67)。被抗人单克隆抗体包 被的微粒能够直接与mAb2322连接。
[0215] 抗 NGAL 抗体 mAb903 用 Cy5 标记（"Ab-Cy5 ")。用 Cy3 标记的 NGAL (NGAL-Cy3)作为 分析物示踪剂/内部校准物。Cy3和Cy5是花青染料家族的反应性水溶性荧光染料。Cy3在 电磁谱的黄色区域（约570nm)中发荧光，但在电磁谱的绿色区域（约550nm)中吸收。Cy5在 电磁谱的红色区域（约650nm或670nm)中发荧光，但在电磁谱的橙色区域（约649nm)中吸 收。参见，例如，〃Technical Information on Probes Conjugated to Affinity-Purified Antibodies and to Other Proteins:Cyanine Dyes(Cy2，Cy3, and Cy5)"，这可借助于超文 本传输协议从万维网上的网站jacsonimmuno. com/technical/f-cy3_5· asp获得，其通过 引用并入本文。
[0216] 一种校准物和7个样品按照表1制备，并如图3所示处理。通常，具有已知浓度的 样品如同它们是测试样品一样进行处理。
[0217] 表 1
[0218]
[0219] 表2列出了每个样品的Cy5/Cy3强度比和用下式测量的NGAL的浓度（即，[分析 物]):
[0221] 其中示踪分析物浓度（即，[示踪剂])为40pM，校正因子F为2. 0, Cy5/Cy3为表 2的第二列中列出的强度比。
[0222] 表 2
[0225] 从表2中可以看出，在已知的（制备的）样品浓度（第1列）与测得的分析物浓 度（第3列）之间具有良好的一致性。
[0226] 实施例2
[0227] NGAL 测定
[0228] 本实施例示范了使用ARCmTEClTNGAL测定和校准物试剂盒（Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)进行的 NGAL 测定。分开制备 NGAL 不踪分析物（NGAL_Cy3) 和抗体偶联物（mAb903-Cy5)，并与试剂盒的组分（例如，NGAL微粒和NGAL校准物）一起使 用。
[0229] 试剂盒中六种NGAL校准物中的五种（即，10、100、500、1000和1500ng/mL的校准 物）如同它们是测试样品一样进行加工和处理。使用Ong/mL的校准物作为制备内部校准 物的稀释剂。对六种中的每一种进行以下步骤。
[0230] L 混合 10 μ L 的 62. 5ng/mlNGAL-Cy3+10 μ L 的每个 NGAL 样品 +2 μ L 800nM Ab 偶 联物。
[0231] 2.温育5分钟。
[0232] 3.添加 2 μ L 的 NGAL0. 1 % 微粒。
[0233] 4.温育5分钟。
[0234] 5.用 HBS-EP 缓冲液（GE Healthcare, Inc.，目录号 BR-1001-88 ;10mM HEPES(4-(2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸），150mMNaCl，3mM EDTA 和 0· 005% Tween-20)洗涤 两次。
[0235] 在步骤1-5完成后，在显微镜上拍摄样品的荧光图像。
[0236] 测量每个样品在Cy3和Cy5通道中的颗粒的荧光强度，并且将值列于以下表3中 的第2和第3列。使用相同的公式，用Cy5/Cy3比（第4列）计算每个样品中的NGAL分析 物浓度（第6列）：
[0238] 其中[示踪剂]为62. 5ng/mL，F为0· 57, Cy5/Cy3为列于表3第四列的强度比。
[0239] 表 3
[0242] 测得的NGAL值与实际NGAL值之间的相关性为100 % (通过对数据作图并拟合至 一条线而获得的值；数据未示出）。这些结果证实，使用本文所述的方法进行测定仅需要一 种校准物（内部校准物）。所有测得的NGAL值均相对于该校准物来确定。
[0243] 例如，我们通过使用不同的微粒量和温育不同的时间段，进一步改变了 NGAL测定 条件，如图4所示。这些结果证实，对于给定的分析物浓度，偶联物或检测抗体（Cy5)与示 踪剂（Cy3)的强度比保持恒定。这进一步证实了内部校准物可以自动校正实验变化。
[0244] 应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且基于此的各种 修改或改变将会由本领域技术人员想到，并且将包含在本申请的精神和范围内以及所附权 利要求书的范围内。
[0245] 2013 年 3 月 15 日提交的、名称为"ASSAY WITH INCREASED DYNAMIC RANGE" 的共 同拥有的、共同未决的申请--序列号为13/833, 655的美国非临时申请，由于其中用于避 免"钩效应"和增加测定动态范围的试剂盒和方法的教导而明确地通过引用全文并入。
[0246] 本文引用的所有出版物、专利和专利申请均为了所有目的通过引用而全文并入本 文。
【主权项】
1. 一种试剂盒，其包含：包含第一标记物的示踪分析物、捕获分析物结合分子和包含 第二标记物的检测分析物结合分子，其中所述捕获分析物结合分子和所述检测分析物结合 分子能够同时与所述示踪分析物结合。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述捕获分析物结合分子附接至固体支持物 上。3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其中所述固体支持物选自颗粒、微粒、珠子、电极和 多孔板。4. 根据权利要求1至3中任意一项所述的试剂盒，其中所述捕获分析物结合分子和/ 或所述检测分析物结合分子之一或两者是抗体或其片段。5. 根据权利要求1至4中任意一项所述的试剂盒，其中所述第一标记物和所述第二标 记物之一或两者是发色团。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其中所述第一标记物和所述第二标记物之一或两者 是荧光团。7. -种对测定进行内部校准的方法，其包括： a) 使捕获分析物结合分子与预定浓度的用第一标记物标记的示踪分析物及预定浓度 的用第二标记物标记的检测分析物结合分子接触，其中所述捕获分析物结合分子和所述检 测分析物结合分子同时与所述示踪分析物结合； b) 测量所获得的第一标记物的信号强度（II。）和第二标记物的信号强度（12。）； c) 将校正因子（F)确定为第二标记物的强度（12。）与第一标记物的强度（II。）的比值； 由此该校正因子的确定用于对所述测定进行内部校准。8. -种确定一个或多个测试样品中的分析物浓度的方法，其包括： a) 在不存在或存在可能包含测试分析物的一个或多个测试样品的情况下，使捕获分析 物结合分子与预定浓度的用第一标记物标记的示踪分析物及预定浓度的用第二标记物标 记的检测分析物结合分子接触，其中所述捕获分析物结合分子和所述检测分析物结合分子 同时与所述示踪分析物结合，并且如果存在的话，同时与所述一个或多个测试样品中的测 试分析物结合； b) 测量在不存在所述一个或多个测试样品时获得的第一标记物的信号强度（II。）和第 二标记物的信号强度（12。）； c) 将校正因子（F)确定为第二标记物的强度（12。）与第一标记物的强度（II。）的比值； d) 测量在存在所述一个或多个测试样品时获得的第一标记物的信号强度（Il)和第二 标记物的信号强度（12);以及 e) 通过将第二标记物的强度（12)与第一标记物的强度（Il)的比值除以校正因子（F) 并减去示踪分析物的预定浓度来确定在所述一个或多个测试样品中的测试分析物的浓度。9. 根据权利要求7至8中任意一项所述的方法，其中示踪分析物的预定浓度在所述捕 获分析物结合分子的结合容量的饱和度以下。10. 根据权利要求8至9中任意一项所述的方法，其中示踪分析物的预定浓度的范围为 从低于预期的测试分析物浓度至高于预期的目标测试分析物浓度约5倍。11. 根据权利要求7至10中任意一项所述的方法，其中使用两步测定形式。12. 根据权利要求11所述的方法，其中当使用两步测定形式时，检测分析物结合分子 的预定浓度等于或超过在第一步中捕获的分析物和示踪分析物的浓度。13. 根据权利要求7至10中任意一项所述的方法，其中使用一步测定形式。14. 根据权利要求13所述的方法，其中当使用一步测定形式时，检测分析物结合分子 的预定浓度超过分析物和示踪分析物的浓度。15. 根据权利要求7至14中任意一项所述的方法，其中所述方法使用自动化或半自动 化系统来进行。16. 根据权利要求7至15中任意一项所述的方法，其中所述捕获分析物结合分子附接 至固体支持物上。17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述固体支持物选自颗粒、微粒、珠子、电极和 多孔板。18. 根据权利要求7至17中任意一项所述的方法，其中所述捕获分析物结合分子和/ 或检测分析物结合分子之一或两者是抗体或其片段。19. 根据权利要求7至18中任意一项所述的方法，其中所述第一标记物是第一发色团 且所述第二标记物是第二发色团。20. 根据权利要求19所述的方法，其中所述第一标记物是第一荧光团且所述第二标记 物是第二荧光团。21. 根据权利要求8至20中任意一项所述的方法，其中步骤b)和d)能够同时或以任 意顺序完成。22. 根据权利要求8至21中任意一项所述的方法，其中步骤d)和e)重复一次或多次。23. 根据权利要求8至22中任意一项所述的方法，其中步骤a)至c)只进行一次。
【专利摘要】本文提供了用于具有内部校准的测定的试剂盒和方法。
【IPC分类】G01N33/543
【公开号】CN105164533
【申请号】CN201380075848
【发明人】S·给达, Q·阮, J·P·斯金纳, S·Y·特亭
【申请人】雅培实验室
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2013年12月20日
【公告号】CA2903709A1, US9005901, US20140273272, WO2014143323A1