struments公司；自动免疫组化染色仪（2D):美国LABVISION公司。倒置相差显微镜：日 本Olympus公司；凝胶成像系统：美国BI0-RAD公司；多功能酶标仪：美国化ermo公司；正 置、倒置巧光显微镜：日本Olympus公司。
[0020] 实施例1
[0021] 取180例肺腺癌组织切片标本及相应94例癌旁组织切片标本，所有切片组织均取 自南通大学附属医院屯、胸外科2004年1月~2009年12月住院手术治疗患者。所有患者 术前均未经过放、化疗，临床数据（包括年龄、性别、分期、肿瘤大小、分化、淋己结转移和远 处转移）均有书面记录。上述180例病例具有完整病史及随访记录，随访截止日期为2014 年5月，随访率100%。
[0022] 免疫组织化学法标本：上述肺腺癌组织180例，所有标本均经病理证实，肿瘤标本 取自术中肿瘤切除的中屯、部位，相应癌旁组织94例，所有标本均来自南通大学附属医院病 理科档案库。所有组织标本均常规10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，蜡块经筛选无明显缺 陷，委托病理科制作成厚度为4mm厚的组织忍片五张，置于冰箱4°C冷藏室储存备用。
[0023] 1)组织忍片的制作
[0024] 180例肺腺癌组织标本和94例相应癌旁组织标本均用10 %甲醒固定，石蜡包埋， 蜡块经过筛选无明显缺陷。制作成组织忍片。主要流程为：1)根据肥染色切片的镜检结 果，在蜡块上有代表性的癌巢区域作标记。2)1:1混合石蜡与蜂蜡，制作空白受体蜡块。在 蜡块上设计10X7孔，共350点组织阵列，然后用组织忍片仪制成TMA空白蜡块。3)将供体 蜡块在标记的点上选取最有代表性的癌巢区域，取直径2mm的组织块，每例各取1个忍。4) 将取好的组织忍转移到受体蜡块的孔中，并取相应癌旁组织做对照。5)组织阵列块在55°C 的恒溫烤箱中加热融合10分钟，在快融化之前放至室溫冷却，使受体蜡块与供体组织融为 一体。6)将组织忍片置于4°C条件下冷冻4小时左右，随后用全自动组织切片机对组织阵 列块进行修正，速度为20mm/转，等修到所有组织忍完全曝露。7)用切片机对组织阵列块进 行切片，将连续切片分别漂在凉水中，使其自然展开，再将切片转移至45°C溫水中展片2分 钟左右，待展开后将其贴在经过防脱片处理的载玻片上惊干。8)将切片置于60°C的环境下 烤片3分钟，58°C继续烤片16h。9)将做好的组织忍片保存于切片盒，置于冰箱4°C冷藏室 备用。
[00幼 2)免疫组化染色巧nVision两步法）
[0026] (1)常规脱蜡水化：脱蜡前，将组织忍片放在60°C的恒溫箱中，烘烤约20分钟。将 已干燥的组织忍片浸于二甲苯中10分钟2次。取出后进行梯度酒精脱水，100%乙醇10分 钟，95 %乙醇10分钟，80 %乙醇10分钟，70 %乙醇10分钟，流水冲洗组织忍片。（2)将组织 忍片置于耐高溫切片架上，置于抑为6. 0的巧樣酸盐缓冲液，高溫抗原修复5分钟，自然冷 却至室溫后用PBS冲洗3次，每次5分钟。（3)取出蒸馈水中的忍片，滴加30%&〇2避光解 育20分钟，W消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馈水冲洗，再将忍片置入PBS缓冲液中浸 泡5分钟，总共3次，然后取出甩干。（4)滴加200yL的鼠抗人MAGE-A9单克隆抗体工作 液（稀释比例为1:50)于组织忍片上，在4°C条件下过夜。（5)第二天，取出组织忍片，复溫 1小时，后置入PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共3次，之后取出甩干。（6)在组织忍片上滴加 200y1的二抗工作液，于室溫解育30分钟，将组织忍片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，一共 3次，之后取出甩干。（7)滴加准备好的显色剂DAB工作液，光镜下控制显色程度，显色完全 后，立即用蒸馈水冲洗，终止显色。（8)室溫下用苏木素复染2分钟，用蒸馈水流水震洗后甩 干。（9)忍片脱水，透明，封片。（10)光镜下观察免疫组化染色结果，细胞相应部位出现栋 黄色作为阳性表现。
[0027] 结果判断：免疫组化结果判断采用双盲法，由两位经验丰富的病理科医师对组织 忍片上的染色结果进行独立评价。根据染色阳性的肿瘤细胞数目所占百分比计为0-100 %， 染色强度按肿瘤细胞着色的深浅计分：无着色为0分，黄色计1分，浅栋色计2分，栋褐色计 3分。MAGE-A9的最终染色得分为染色强度与阳性细胞染色面积的乘积。MAGE-A9表达分数 的分界点由X-tile软件得出。评分如下：0-100为低表达或无表达，101-300为高表达。
[0028] 所有数据均用统计软件SPSSV. 20. 0和STATAV. 9. 0处理，计量资料W均数+ 标准差（X站:）表示，组间比较采用单因素方差分析，有统计学意义的各临床病理参数间 用Cox比例风险回归模型进行多因素分析，MAGE-A9表达与NSCLC患者的预后关系分析用Kaplan-Meier生存分析，所有检验结果P<0. 05为差异有统计学意义。
[0029] 180例肺腺癌组织切片标本行免疫组化染色，MAGE-A9蛋白阳性表达于腺癌组织 的细胞质和细胞核中，呈栋黄色，而大部分癌旁组织无表达，见免疫组化照片（图1)。免疫 组化染色结果显示180例肺腺癌组织MAGE-A9蛋白表达阳性率为42. 78% (77/180)，癌旁 组织表达阳性率22. 34% (21/94)，两者比较差异显著，有统计学意义（P= 0. 001)(表1)。
[0030] 表1肺腺癌组织及癌旁组织中MAGE-A9蛋白的表达
[0031]
[0032]冲 <0.05。
[003引 MAGE-A9在肺腺癌中的阳性表达与肿瘤分化（X2= 4. 759，P= 0. 029)、直径大小 (x2= 6.205,P= 0.013)有关，而与年龄、性别、淋己结转移和?!分期无关（表2)。
[0034] 表2MAGE-A9的表达与肺腺癌患者临床病理参数的关系
[0035]
[0036]
[0037] 冲<0.05。
[0038] 用Log-rank检验行单因素分析，显示肿瘤细胞中MAGE-A9表达率（P<0. 001)，性别 (P= 0. 002)，肿瘤直径（P= 0. 001)，分化程度（P= 0. 001)，淋己结转移（P= 0. 002)，TNM 分期（P= 0.001)与肺腺癌预后相关。将上述因子纳入C0X比例风险模型多因素分析，显 示MAGE-A9在肺腺癌组织中高表达（P<0. 001)、男性（P= 0. 007)、分化差（P= 0. 001)和 淋己结转移（P= 0. 037)是肺腺癌预后差的独立预后因素（表3)。Kaplan-Meier生存曲 线显示MAGE-A9表达阳性组比阴性组五年生存率低（图2)。
[0039] 表3肺腺癌预后的单因素和多因素分析
[0040]
[0041]
[0042]冲 <0.05。
[0043] 可见，MAGE-A9蛋白的表达在肺腺癌组织中明显升高。肺腺癌组织中的MAGE-A9表 达水平与肿瘤分化和直径大小有关。MAGE-A9在肺腺癌组织中高表达是肺腺癌预后差的独 立预后因素。
[0044] 实施例2
[0045]DsiRNA设计
[0046] 针对人MAGE-A9的S段不同的SiRNA序列及阴性对照siRNA(negativecontrol, NC)由上海Invitrogen公司设计并完成，序列如下：
[0047]MAGE-A9#1 :正义链：5, -GGUGGCUGAGUUGGUUCAUTT-3,；
[0048] 反义链：5' -AUGAACCAACUCAGCCACCTT-3' ；
[0049]MAGE-A9#2 :正义链：5, -GCAAAGCCUCCGAGUUCAUTT-3,；
[0050] 反义链：5' -AUGAACUCGGAGGCUUUGCTT-3' ；
[0051]MAGE-A9#3 :正义链：5, -CCAGCUAUGAGAAGGUCAUTT-3,；
[0052]反义链：5'-AUGACCUUCUCAUAGCUGGTT-3'。
[00閲。