合膜过滤后进样分析。 采用C18固相萃取小柱净化样品，降低了干扰，提高了灵敏度和重现性。通过上述步骤处理 后，可以净化样品，达到去除干扰的效果。
[0034] ②超高效液相色谱（UPLC)进样并分离。所述液相色谱的参数设置为：
[0035] 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3L 8 μπι 2. lX50mm(Waters 公司）；柱温：35°C ;
[0036] 采用水相和有机相梯度洗脱，所述水相为A :0.1 %甲酸水溶液；所述有机相为B : 0. 01 %甲酸-乙腈溶液；梯度洗脱条件详见表1。
[0037] 待测组份经过色谱柱有效分离，是准确定量的前提和保证。而合适的色谱条件，如 色谱柱，柱温，流动相，梯度洗脱条件都会影响分离效果。其中，色谱柱填料的性质决定了其 适用范围。ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱设计用于在反相UPLC条件下保留和分离极性有机 化合物。麦香类化合物的特性适合采用这款色谱柱进行分离。流动相的组成也会影响到分 离的效果；通常选择水相和有机相进行梯度洗脱。流动相中加入甲酸，提高了被测化合物的 离子化效率、调节 PH、改善峰形，从而提高灵敏度和分离效果。梯度洗脱程序是流动相的比 例及流速随时间变化的过程，这样可以调节待测化合物在色谱柱上的保留特性，保证各组 份被洗脱时不被其他组份干扰从而准确定量，待测物全部流出后，要加大有机相的比例以 充分清洗色谱柱。本方法中，0~6. 0分钟，待测组份依次被洗脱；6. 0~8. 0分钟，清洗色 谱柱；8. 0~10. 0分钟，重新回到初始条件，为下次进样做准备。
[0038] ③串联质谱（MS/MS)分析。待测组份经过色谱柱分离后，在高压电场和载气的作 用和带动下发生电离，然后进入质谱检测器被检测。质谱方法包括诸多参数，包括锥孔电 压、碰撞能量、母离子、定量子离子、定性子离子，驻留时间等。经过实验，质谱调谐参数如 下：电喷雾离子化正离子模式ESI(+);毛细管电压为700V，一级锥孔电压22V;去溶剂气 温度为400°C ;去溶剂气流量为1000L/h ;锥孔反吹气流量为100L/h ;碰撞气氩气流量为 0. 15ml/min。所述质谱参数分别详见表2。
[0039] ④数据采集并定量分析四种麦香风味物质的含量。
[0040] 制作标准曲线：称取适量的麦芽酚、DMHF、2-乙酰吡咯、EMHF，用乙腈溶解配制成 1000mg/L的单组份标准溶液；然后将上述单组份标准溶液用0. 1%甲酸水溶液溶解配制成 浓度为 50 μ g/L、100 μ g/L、200 μ g/L、400 μ g/L、500 μ g/L、1000 μ g/L 的混合标准溶液。将 上述标准溶液盛放于样品瓶中，经自动进样器进样、超高效液相色谱分离和电喷雾离子化 后进入质谱检测器，得到标准样品的谱图。以各组分的峰面积为y，浓度为X，绘制一条标准 曲线（详见表3)，强制过原点。
[0041] 检测待测样品，：分别用6ml乙腈和6ml水活化C18小梓。啤酒样品和发酵液要先轺 声棑气10分钟后h样，耒汁样品无需此橾作。取Iml样品流经活化后的C18小梓，Iml轺纯 水淋洗，乙腈和0. 1%甲酸混合溶液（比例为50 :50) I. 5ml分两次洗脱，洗脱液经0. 22 um 复合腊讨滤后讲样分析。将所得谱图与标样对照，以化合物色谱峰的保留时间和宙件离子 对为定性依据，以定量离子对为定量依据。将定量离子对的峰面积带入标准曲线，计算样品 中麦芽酚、DMHF、2-乙酰吡咯和EMHF的含量。检测结果见表5。
[0042] 表5 :啤酒样品麦香物质含量（μ g/L)
[0043]
[0044] 实施例2 :
[0045] 检测麦汁样品中的四种麦香类风味物质（麦芽酚（Maltol)、2,5_二甲基-4-羟 基-3(2H)_呋喃酮（DMHF)、2_乙酰吡咯（2-Acetylpyrrole)和4-羟基-5-乙基-2-甲 基-3 (2H)呋喃酮（EMHF))的方法；麦汁样品来自某啤酒企业的3个工厂的10个样品。所 述方法包括以下步骤：
[0046] ①麦汁样品前处理。分别用6ml乙腈和6ml水活化C18小柱。取Iml样品流经活 化后的C18小柱，Iml超纯水淋洗，乙腈和0. 1 %甲酸混合溶液（比例为50 :50) I. 5ml分两 次洗脱，洗脱液经〇. 22 μ m复合膜过滤后进样分析。。
[0047] 步骤②-步骤④与实施例1相同。检测结果见表6。
[0048] 表6 :13度麦汁麦香检测数据（μ g/L)
[0050] 实施例3 :
[0051] 检测麦汁样品中的四种麦香类风味物质（麦芽酚（Maltol)、2,5-二甲基-4-羟 基-3(2H)_呋喃酮（DMHF)、2_乙酰吡咯（2-Acetylpyrrole)和4-羟基-5-乙基-2-甲 基-3 (2H)呋喃酮（EMHF))的方法；与实施例2不同的是，
[0052] ①麦汁样品前处理。分别用7ml乙腈和7ml水活化C18小柱。取Iml样品流经活 化后的C18小柱，0. 9ml超纯水淋洗，乙腈和0. 1 %甲酸混合溶液（比例为50 :50) I. 6ml分 两次洗脱，洗脱液经〇. 22 μ m复合膜过滤后进样分析。
[0053] 检测结果见表7。
[0054] 表7 :13度麦汁麦香检测数据（μ g/L)
[0055]
[0056] 实施例4 :
[0057] 检测啤酒中的四种麦香类风味物质（麦芽酚（Maltol)、2,5_二甲基-4-羟 基-3(2H)_呋喃酮（DMHF)、2_乙酰吡咯（2-Acetylpyrrole)和4-羟基-5-乙基-2-甲 基-3 (2H)呋喃酮（EMHF))的方法。与实施例1不同的是，
[0058] ①啤酒样品前处理。分别用5ml乙腈和5ml水活化C18小柱。啤酒样品和发酵液 要先排气后上样。取Iml样品流经活化后的C18小柱，I. Iml超纯水淋洗，乙腈和0. 1 %甲 酸混合溶液（比例为50 :50) I. 4ml分两次洗脱，洗脱液经0. 22 μ m复合膜过滤后进样分析。
[0059] 检测结果见表8。
[0060] 表8 :啤酒样品麦香物质含量（μ g/L)
【主权项】
1. 检测啤酒和麦汁中的四种麦香类风味物质的方法，所述四种麦香物质为麦芽酚 (]\&11切1)、2,5-二甲基-4-羟基-3(2!1)-呋喃酮（01册）、2-乙酰吡咯（2-厶。6七71口7^〇16) 和4-羟基-5-乙基-2-甲基-3 (2H)呋喃酮（EMHF);其特征在于：所述方法包括以下步骤： 待测样品经前处理后，超高效液相色谱进样并分离，串联质谱定量分析四种麦香风味物质 的含量。2. 根据权利要求1所述的检测啤酒和麦汁中的四种麦香类风味物质的方法，其特征在 于：包括以下步骤： ① 样品前处理：取lml样品流经活化后的C18小柱，采用0. 9-1.lml的水淋洗，然后采 用1.4-1. 6ml的乙腈-0. 1%甲酸混合溶液分两次洗脱，洗脱液经复合膜过滤； ② 超高效液相色谱分离：将步骤①处理后的样品进行并分离；所述液相色谱的色谱柱 为ACQUITYUPLCHSST31.8ym2.lX50mm;柱温为35°C;采用水相和有机相梯度洗脱，所 述水相为A:0. 1 %甲酸水溶液；所述有机相为B:0. 01 %甲酸-乙腈溶液； ③ 串联质谱（MS/MS)分析：步骤②分离得到的样品经串联质谱进行分析；质谱参数 为：电喷雾离子化正离子模式ESI(+);毛细管电压为700V，锥孔电压22V;去溶剂气温度 为400°C;去溶剂气流量为1000L/hr;锥孔反吹气流量为100L/hr;碰撞气氩气流量为 0. 15ml/min； ④ 数据采集并定量分析四种麦香风味物质的含量： (a) 制作标准曲线：称取适量的麦芽酚、DMHF、2-乙酰吡略、EMHF用0. 1%甲酸水溶液 溶解配制成浓度为 50μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、500μg/L、1000μg/L的混合 标准溶液；经超高效液相色谱分离和串联质谱分析，得到标准样品的谱图；以各组分的峰 面积为y，浓度为X，绘制一条标准曲线； (b) 检测待测样品：将步骤③得到的定量离子对的峰面积带入标准曲线，计算样品中 麦芽酚、DMHF、2-乙酰吡咯和EMHF的含量。3. 根据权利要求2所述的检测啤酒和麦汁中的四种麦香类风味物质的方法，其特征 在于：步骤①和步骤④（b)中所述C18小柱采用5-7ml乙腈和5-7ml水分别活化；所述乙 腈-0. 1 %甲酸混合溶液中乙腈和0. 1 %甲酸的体积比为1:1。4. 根据权利要求3所述的检测啤酒和麦汁中的四种麦香类风味物质的方法，其特征在 于：步骤①所述的复合滤膜为〇. 22μm复合滤膜；所述步骤①中啤酒样品要先排气后上样； 步骤②的梯度洗脱条件详见表1 ;步骤③的质谱参数详见表2 ;步骤④的标准曲线详见表 3 ： 表1.液相色谱的梯度洗脱条件表2.检测对象的物理指标和质谱的定性定量参数表3 :标准曲线和重现性数据
【专利摘要】本发明针对现有技术存在的上述问题，提供了一种利用超高效液相色谱加串连质谱(UPLC-MS/MS)检测啤酒中和麦汁中的四种麦香类风味物质的方法。所述四种麦香物质为麦芽酚(Maltol)、2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮(DMHF)、2-乙酰吡咯(2-Acetylpyrrole)和4-羟基-5-乙基-2-甲基-3(2H)呋喃酮(EMHF)；所述方法包括以下步骤：待测样品经前处理后，超高效液相色谱进样并分离，串联质谱定量分析四种麦香风味物质的含量。本发明涉及的四种麦香物质沸点较高，分别为215℃，220℃，248℃和285℃；且含量低。采用UPLC-MS/MS检测高沸点的微量啤酒风味物质；避免了气相色谱法的进样口250℃高温会导致样品中残留的糖和氨基酸反应生成呋喃酮、麦芽酚等物质，进而严重影响数据准确性的问题。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105259266
【申请号】CN201510710925
【发明人】董建军, 杨朝霞, 李梅, 陈华磊, 郝俊光, 尹花, 余俊红, 田玉红, 张翠
【申请人】青岛啤酒股份有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年10月28日