Press, New York, 1991 ；以及 Carillo，H. ,and Lipman，D·，SIAM J. Applied Math. ,48:1073(1988))中所描述的。
[0289] 设计确定同一性的优选的方法以给出测试序列之间的最大匹配。确定同一性 和相似性的方法编码在公众可获得的计算机程序中。用来确定两序列之间的同一性和 相似性的优选的计算机程序方法包括例如GCG程序包（Devereux, J.，et al.，NucIeic Acids Research 12(1) :387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN、 F. et al.，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990))。BLAST X 程序可以公开地从 NCBI 及其他来源 (BLAST Manual, Altschul, S. , et al. , NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894 ；Altschul,S.,et al. ,J. Mol. Biol. 215:403-410(1990))获得。众所周知的 Smith Waterman 算法也可以用来 确定同一*性。
[0290] 用于多肽序列比较的优选参数包括以下：算法：Needleman and Wunsch，J. Mol. Biol.48:443-453(1970);比较矩阵：BL0SSUM62,来自他11衍1?)打&11(1!1611衍1?)打，？『〇。· Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919(1992);空位罚分（Gap Penalty) :12;和空位长度罚 分：4。这些参数可用的程序公开可用，作为来自Genetics Computer Group的"Ogap"程序， 位于麦迪逊，WI。上述参数为用于氨基酸比较的默认参数（连同对于末端空位（end gap) 没有罚分）。
[0291] 用于核酸比较的优选参数包括以下：算法：Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453(1970);比较矩阵：匹配=+10,不匹配=0 ;空位罚分：50 ;空位长度罚 分：3。可用，作为Gap程序，来自Genetics Computer Group，位于麦迪逊，威斯康辛州。上 面所给出的是用于核酸比较的默认参数。
[0292] 可选地，在确定氨基酸相似度中，本领域技术人员还可以考虑所谓的"保守"氨基 酸替换，其对于本领域技术人员将是清楚的。保守氨基酸替换是指具有相似侧链的残基的 可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、和异亮氨 酸；具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组为 天冬酰胺（asparagine)和谷氨酰胺（glutamine);具有芳香族侧链的氨基酸组是苯丙氨 酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧 链的氨基酸组是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸替换组是：缬氨酸-亮氨酸-异 亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺。 本文中公开的氨基酸序列的替换变体是其中在所公开的序列中移去至少一个残基并在其 位置上插入不同的残基的那些。优选地，氨基酸变化是保守的。对于天然存在氨基酸中的 每一个优选的保守替换如下：Ala对Ser ;Arg对Lys ;Asn对Gln或His ;Asp对Glu ;Cys对 Ser 或 Ala ;Gln 对 Asn ;Glu 对 Asp ;Gly 对 Pro ;His 对 Asn 或 Gln ;Ile 对 Leu 或 Val ;Leu 对 Ile 或 Val ;Lys 对 Arg, Gln 或 Glu ;Met 对 Leu 或 lie ;Phe 对 Met、Leu 或 Tyr ;Ser 对 Thr ; Thr 对 Ser ;Trp 对 Tyr ;Tyr 对 Trp 或 Phe ;以及 Val 对 Ile 或 Leu。
[0293] 抗体
[0294] 本发明的一些方面涉及使用与促炎细胞因子特异性地结合的抗体或抗体片段。 在例如 Harlow 和 Lane(1988，Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory PressjCold Spring Harbor, NY)^W091/19818 ；W0 91/18989 ；W0 92/01047 ；W0 92/06204 ;W0 92/18619;和US 6, 420, 113以及其中引用的参考文献中描述了用于产生与 这样的多肽特异性地结合的抗体或抗体片段的方法。如本文所用的术语"特异性地结合"包 括低和高亲和力的特异性结合。可以例如，通过具有至少约10 4M的Kd的低亲和力抗体或 抗体片段显示出特异性结合。也能够通过高亲和力的抗体或抗体片段显示出特异性结合， 例如，具有至少约10 7M、至少约10 SM，至少约10 9M,至少约10 WM，或可具有至少约10 11M或 10 12M或更大的Kd的抗体或抗体片段。
[0295] 肽樽拟物
[0296] 肽样分子（称为肽模拟物）或非肽分子，其与本文所定义的促炎细胞因子或其受 体多肽特异性地结合，并且其可应用于本文中定义的本发明的方法（用于评价促炎细胞因 子的表达水平）并利用本领域本身已知的方法可以被识别，如，例如在通过引用并入本文 的US 6, 180, 084中详细描述的。这样的方法包括如筛选肽模拟物文库、肽文库、DNA或cDNA 表达文库、组合化学（combinatorial chemistry)和，特别有用的，菌体展示文库。通过 将文库与基本上纯化的促炎细胞因子、其片段或其结构类似物接触，可筛选这些文库用于 促炎细胞因子的这类肽模拟物。
[0297]
[0298] 在本文中和在其权利要求书中，动词"包含（包括）"和其变型以其非限制性含义 使用，意为包括该词之后的项，但没有特别提及的项也不排除在外。此外动词"由…组成"可 以由"基本上由...组成"替换，是指本文中定义的方法相比于具体识别的步骤可以包含一 个或多个其它步骤，所述一个或多个其他步骤不改变本发明的独特特性。此外，通过不定冠 词"一种"或"一个"提到元素时并不排除这样的可能性，即存在多于一种的元素，除非上下 文清楚地要求有且仅有一种元素。不定冠词"一个"或"一种"通常是指"至少一种"。
[0299] 本说明书中引用的所有专利和参考文献在此通过参考全文引入。下面的实施例是 仅出于阐述目的而提供，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。
【附图说明】
[0300] 图1.半胱天冬酶-1抑制剂（VRT)对IL-I β产生的影响。将人PBMC暴露于几种 PRR激动剂24h以刺激IL-I β产生。除了 PRR配体，用PRR配体在半胱天冬酶-1抑制剂存 在下刺激PBMC (左上图）。将50位受试者的PBMC包括在这些实验中。在独立图（panel) 中，显示有或没有半胱天冬酶-1抑制剂的不同PPR激动剂。由Elisa测定IL-I β。
[0301] 图2.依赖于ATG16L1基因型的半胱天冬酶-1抑制剂（VRT)的效果。将50位受 试者针对ATG16L1基因型进行基因分型，此后每种基因型表达IL-I β产生。显示了三种不 同PRR配体，MDP、LPS以及MDP和LPS的组合。通过Elisa测定IL-I β。左图；显示了每 位受试者的IL-I β产生。右图；显示箱形图（Box-plot)。
[0302] 图3.依赖于LPS-和MDP-诱导的IL-I β产生的半胱天冬酶-1抑制剂（VRT)的 效果。在用LPS或MDP刺激后，将受试者分级为高（>2000pg.ml)、中（1000-2000pg/ml)和 低（〈lOOOpg. minL-1 β产生者。与载体对照相比，半胱天冬酶-1抑制的作用以抑制百分 比在每组受试者中显示。
[0303] 图4.健康个体中的TNF α产生。将来自104位个体的PMBC根据标准方法进行 分离。通过24h暴露于10ng/ml大肠杆菌LPS或IO6HK假丝酵母菌（Candida)/ml来测定 TNFa产生能力。然后，使用ELISA测定TNFa。
[0304] 图5. LPS-诱导的和假丝酵母菌-诱导的TNF a产生的关联性。用大肠杆菌LPS 或HK白色念珠菌（Candida albicans)刺激来自104位受试者的PMBC。通过24h暴露于 10ng/ml大肠杆菌LPS或IO6HK白色念珠菌/ml来测定TNFa产生能力。然后，使用ELISA 测定TNFa。该图示出了，不是所有受试者都显示为对于LPS和假丝酵母二者均为高TNF a 产生者。
[0305] 图6.克罗恩氏患者的分级。从23位IBD患者中分离PMBC，并用大肠杆菌 LPS(10ng/ml)或 Pam3cys/MDP(10ug/ml 和 10ug/ml)刺激 24 小时。然后用 ELISA 测定 TNFa。MDP(胞壁酰基-二-肽（Muramyl-Di-Ρ印tide))被认为是疾病特异性刺激，因为这 将被细胞内N0D2受体识别。
[0306] 图7.将来自2位RA患者的PMBC用IgG对照（Ivlg)或3种不同TNF α抑制剂刺 激30分钟。然后加入IO6HK假丝酵母/ml。24h后，用ELISA测定E-I β产生。在4yg/ ml的剂量中测试抗TNF α，其为将出现在抗TNF α治疗后的RA患者中的剂量。注意所有3 种TNFa阻断剂（blockers)均降低IL-I β产生。已知TNFa利于通过假丝酵母菌暴露诱 发的PMBC的IL-I β产生。
[0307] 图8.将188位痛风患者的PBMC用媒介物（介质，Medium) (RPMI1640) Pam3Cys，或 MSU/C16. 0刺激24h。之后，利用ELISA测定IL-Ιβ。这里看出，MSU/C16. 0(痛风特异性 的）是IL-I β的有力的诱导剂。
[0308] 图9. MS患者的分级。将从4位MS患者和4位年龄和性别匹配的健康对照分离的 PBMC 用 RPMI、白色念珠菌（I. lOVml)、M0G 肽（10 μ g/ml)、抗-CD3/CD28 (1 μ g/ml :0· 1 μ g/ ml)以及 MOG/ 抗-CD3/28 (10 μ g/ml 和 I μ g/ml :0.1 μ g/ml)的组合刺激 7 天。图 9A 表明 MS患者的IL-17A产生在暴露于MOG/抗-⑶3/28后，在与健康对照相比时，强烈上调。图9B 显示在MS患者中MPBC的IL-22产生在暴露于白色念珠菌和MOG/抗-⑶3/28后，当与对照 相比时，是升高的。有趣的是，在MOG/抗-CD3/28刺激后IL-22产生是强烈上调的。在MS 患者和健康对照之间的IFN-γ产生中没有观察到明显差异，尽管白色念珠菌诱导的IFN-g 略高（图9C)。
[0309] 表L炎症件疾病基于细朐闵子/B细朐参与的分级
[0311] 表2 :促炎细朐闵子或B细朐的已知抑制剂
[0313] 实施例
[0314] 实施例1
[0315] 材料和方法
[0316] 分离人外周血单核细胞和体外细胞因子产生。从健康志愿者或患有C⑶的患者 的肘静脉（cubital vein)中提取静脉血到IOml的EDTA管中（Monoject，Covidien，曼 斯菲尔德，马萨诸塞州，USA)。通过将在无致热原生理盐水中1:1稀释的血液经菲科帕克 (Ficoll-Paque) (Pharmacia Biotech，匹兹堡市，宾夕法尼亚州，USA)密度离心来获得单核 细胞部分。将细胞在生理盐水中洗涤两次并悬浮在补充有庆大霉素 l〇mg/ml、L-谷氨酰胺 IOmM和丙酮酸盐（pyruvate) IOmM的培养基（RPMI，Invitrogen，卡尔斯巴德市，加利福尼 亚，USA)中。在Coulter计数器（Coulter Electronics，布雷亚市，加利福尼亚，USA)中计 数细胞，并将其数量调整到5xl06细胞/ml。
[0317] 将100 μ 1体积的总共5xl05的单核细胞加入到圆底96孔板（Greiner，门罗市， 北卡罗来纳州，美国）中，并用100 μ 1培养基（阴性对照），或LPS(10ng/ml，Sigma，M0， USA)、Pam3Cys(10μg/ml，EMC Microcollections，图宾根，德国）、鞭毛蛋白（TLR 5 配 体）、MDP (10 μ g/ml，Sigma，M0, USA)培养。24小时后，收集上清液并贮存在-20°C直至检 测。将来自50位的健康供体组的PBMC用明确定义的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR)配体组刺激。供体血获自Sanquin血库（Sanquin Blood bank)，奈梅亨市， 荷兰。培养24小时后，利用市售ELISA试剂盒（R&D Systems，MN，USA)测定IL-I β。
[0318] 用于ATG16L1 Thr300Ala多态性的基因分型。从全血中通过使用分离试剂盒 Puregene (Gentra Sytems，MN，USA)根据生产商的方法分离 DNA。针对 ATG16LlThr300Ala 多 态性存在的基因分型是通过在7300ABI实时聚合酶链式反应系统（Applied Biosystems， CA，USA)上应用TaqMan单核苷酸多态性（SNP)分析C_9095577_20来进行的。
[0319] 结果
[0320] 原代人细胞的离体研究。在受试者中比较了半胱天冬酶-1抑制剂降低IL-I β产 生的能力。将来自50位的健康供体组的PBMC用明确定义的模式识别受体配体组刺激，该配 体组与肠内炎症相关（例如LPS-TLR 4配体、Pam3Cys-TLR 2配体、鞭毛蛋白-TLR 5配体、 MDP-NOD 2配体，和这些配体的若干组合）。图IA显示LPS、Pam3cys和MDP是IL-I β经由 人PMBC产生的强诱导剂。发现鞭毛蛋白（TLR 5配体）是IL-I β产生的弱诱导剂。当LPS 或Pam3cys与MDP组合时，观察到IL-I β产生的强烈上调（图1Α)。热灭活的大肠杆菌显 示是IL-I β的潜在诱导剂，可能是由于存在于整个微生物上的多个TLR/NLR配体。
[0321] 半胱天冬酶-1抑制剂（VRT)表现出对经由大批刺激的IL-I β刺激显著的抑制作 用，这些刺激包括纯化的TLR配体、肽聚糖的胞壁酰二肽组分（N0D2激动剂），以及整个革 兰氏阴性肠细菌如大肠杆菌（图1)。虽然MDP为IL-Ιβ的弱诱导剂，但半胱天冬酶-1抑 制仍然显著地（Ρ〈〇. 03)减少IL-Ιβ产生。但有趣的是，当IL-Ιβ产生被LPS、LPS/MDP、 Pam3cys/MDP或HK大肠杆菌强烈升高时，通过半胱天冬酶-1抑制剂（VRT)的抑制IL-I β 产生则更加明显（图1)。
[0322] 依赖于ATG16L1基因型的半胱天冬酶-1抑制剂的效果。由于事实上增强的 IL-I β产生与非功能性的自噬机制关联，进行了下一组分析，包括评价半胱天冬酶-1抑制 剂（VRT)的效果是否依赖于ATG16L1基因型。用几种配体刺激后，对于ATG16L1基因型， IL-I β产生没有差异（图2)。半胱天冬酶-1抑制剂（VRT)在所有亚组的个体中同样有效， 这不依赖于其在自噬基因 ATG16L1中的基因型（图2)。
[0323] 依赖于IL-Ιβ产生能力的半胱天冬酶-1抑制剂的效果。在下一组实验中，我们 评价了以下构思：半胱天冬酶-1抑制剂（VRT)的效果可能依赖于个体产生高、中，或低的 IL-I β的量的能力。如图3所示，虽然半胱天冬酶-1抑制剂（VRT)抑制大于80%的由LPS 诱导的IL-I β产生，但抑制由克罗恩氏病特异性的刺激物MDP诱导的IL-I β强烈地依赖 于初始产生：在高产生者中85%抑制，在低产生中70%抑制，而在低产生中仅34%抑制。
[0324] 讨论
[0325] 半胱天冬酶-1抑制剂（VRT)是IL-I β产生的强抑制剂，有希望在未来用于治疗 IL-I β -依赖性疾病如克罗恩氏病。该特别的半胱天冬酶-1抑制剂用于体外抑制人原代细 胞中的IL-I β是非常有效的。
[0326] 为了识别最可能受益于用半胱天冬酶-1抑制剂治疗的患者，我们研究了其在具 有各种Τ300Α ATG16L1基因型的个体中抑制IL-Ιβ的能力（4)。用于本研究的半胱天冬 酶-1抑制剂（VRT)能够非常有效地抑制IL-Ιβ，不依赖于Τ300Α ATG16L1多态性。多种基 因型之间在IL-I β释放中的差异，如先前报告的（4)，并未在本研究中重复。该原因尚不清 楚，虽然用于这些研究的不同MDP批次可能是其中的一个原因。MDP混有小量的LPS以模 拟可能的市售产品污染的其它实验也不能提供基因型之间的不同IL-I β产生差异（未示 出）。
[0327] 用于个性化药物（personalised medicine)的第二方法是为了评价半胱天冬 酶-1抑制剂（VRT)是否在在响应用LPS，或用为与克罗恩氏病尤其相关的刺激物N0D2激 动剂MDP的非特异性刺激中展现高、中，或低的产生IL-I β的能力的个体中是同等有效的。 有趣的是，虽然半胱天冬酶-1抑制剂（VRT)强烈抑制由有力的非特异性刺激物LPS诱导的 IL-I β产生，而由克罗恩氏病特异性的刺激物MDP诱导的IL-I β抑制强烈地依赖于初始 产生：在高产生者中由半胱天冬酶-1抑制剂诱导的85%抑制，在低产生中70%抑制，而在 低产生中仅34%抑制。这强有力地表明半胱天冬酶-1抑制剂在用MDP刺激后释放高量的 IL-I β的高-和中-应答个体可能是最有效的。用半胱天冬酶-1抑制剂的个性化（个人 化）治疗方案，基于个体患者的IL-Ιβ产生状态，似乎因此有希望未来用于克罗恩氏病的 治疗。
[0328] 以将患有（自身）炎症性疾病的患者组群分级为高和低细胞因子产生者的这种方 法可适用于所有基于当前使用的生物疗法的治疗。患者分级对于不太可能成功的限制性治 疗和有潜在重要的副作用的患者而言，以及由于这样的个性化方法显著的成本节省方面对 于卫生保健系统而言都可能是非常有意义的。
[0329] 实施例2
[0330] 材料和方法
[0331] 健康个体的分级。按照在实施例1中描述的分离104位个体的PBMC。将100 μ 1 体积的总共5χ105的单核细胞加入到圆底96孔板（Greiner，门罗市，北卡罗来纳州，美国） 中，并用100 μ 1培养基（阴性对照），或LPS(10ng/ml，Sigma，M0, USA)、或HK白色念珠菌 (IOfVml)培养。24小时后，收集上清液并贮存在-20°C直至检测。培养24小时后，利用市 售 ELISA 试剂盒（R&D Systems，MN，USA)测定 TNF α。
[0332] 结果