[0333] 评价每个个体的TNFa产生。基于产生TNFa的内在能力，将健康个体分类为低、 中和高TNF a的产生者（见图4)。在将PBMC暴露于LPS后，将37数目的个体分类为TNF a 产生者，40位作为中产生者以及27位作为高产生者（图4a)。每种类别的平均TNFa产生 分别为363ng/ml、1120pg/ml和1838pg/ml。图4b示出在暴露于热灭活的（HK)白色念珠 菌24小时后的人PBMC的TNF a产生。如用于LPS刺激那样，将个体分类成相似的组。每 种类别的平均 TNFa 产生分别为 10. 182ng/ml、19. 761pg/ml 和 29. 524pg/ml。
[0334] 为了检查受试者是否总是独立于刺激物产生高浓度的TNFa，将LPS诱导和白色 念珠菌诱导的TNFa产生进行了关联。图5表明，R为0.5111，指示并不是所有的受试者在 暴露于LPS或HK白色念珠菌后都产生高TNF a。
[0335] 讨论
[0336] 利用大数目的个体，其显示可以将每位受试者基于TNF a产生分级成低、中、以及 尚广生者。有趣的，可以看到在暴露于白色念珠囷或LPS后个体不是总广生尚TNF a。
[0337] 实施例3
[0338] 材料和方法
[0339] 克罗恩氏病患者的分级。筛查24位患有克罗恩氏病的患者其细胞因子分布 (TNFa)。按照在实施例1中所描述的分离PBMC。将PBMC暴露于疾病相关的刺激物 LPS (10ng/ml)、Pam3Cys (10 μ g/ml)、胞壁酰二肽（MDP) (10 μ g/ml)和 Pam3Cys/MDP。MDP 是 熟知的N0D2配体并被认为是疾病特异性的。
[0340] 结果
[0341] 基于在LPS暴露□□后产生TNFa的能力，将IBD患者分类为低（低于250pg/ml)， 中（在>250和<500pg/ml之间）和高（>500pg/ml)的TNFa产生者。图6a表明暴露于LPS 后的PBMC的TNFa产生。依赖于TNFa的浓度，将IBD患者分类为低、中、高的TNFa产生 者。图6b表明暴露于Pam3Cys/MDP之后的PBMC的TNF a产生。与LPS类似的，IBD患者 可以分为3组。低（低于250pg/ml)、中（在>250和<500pg/ml之间）和高（>500pg/ml)。
[0342] 讨论
[0343] 利用大数目的个体IBD患者，其揭示每位受试者产生不同溶度的TNFa并由此可 以分级成低、中、高产生者。假定LPS只激活TLR4,而假设MDP/Pam3Cys激活TLR2和N0D2 通路两者。TLR2和N0D2通路表现出较强的协同作用。这两种途径都与疾病相关联。
[0344] 有趣的是，疾病有关的触发因子（trigger)Pam3cys/MDP可以用于分级IBD患者。 如针对RA患者所看到的，在暴露于LPS后个体的TNF α产生不与pam3cys刺激后的TNF α 广生尚度相关。
[0345] 实施例4
[0346] 材料和方法
[0347] 分级RA患者。在开始生物治疗之前，筛查RA患者基础细胞因子分布（basic cytokine profile)。按照在实施例1中所描述的分离PBMC。将PBMC用一系列刺激物刺 激，包括LPS、Pam3Cys、和白色念珠菌。此外，我们添加了几种生物制剂（4 μ g/ml的修美乐、 依那西普或高利单抗，所有都来自Sanquin，荷兰，IgIV(Nanogam))到培养系统中以探讨特 定生物制剂对离体细胞因子产生的影响。将来自RA患者的PBMC用IgG对照（IvIg)或如 上所定义的3种不同TNFa抑制剂温育30分钟。此后加入IO 6HK假丝酵母/ml。24h后， 利用ELISA测定IL-I β。在4 μ g/ml的剂量中测试抗TNF α，其为将出现在抗TNF α治疗 后的RA患者中的剂量。
[0348] 结果
[0349] 如图7所示，可以基于其IL-Ιβ的产生分级来自RA患者的PBMC。注意到所有3种 TNFa阻断剂均减少IL-I β产生。已知TNFa有助于由白色念珠菌暴露引发的经由PBMC 的IL-I β产生。
[0350] 讨论
[0351] 基于TNFa的产生，TNFa有助于在用HK白色念珠菌刺激后通过免疫细胞产生 IL-I β。通过利用中和TNF a策略，可以调节体外产生TNF a的生物活性。有趣的是，第一 个结果表明测试的抗TNF形式（modality)的中和能力有差异。
[0352] 实施例5
[0353] 材料和方法
[0354] 分级MS患者。按照在实施例1中所描述的分离PBMC。将来自MS患者和年龄/性 别对照的 PBMC 暴露于白色念珠菌（I. 106/ml)、抗-CD3/CD28(1 μg/ml :0· I μg/ml)、M0G(MS 相关的肽，10 μ g/ml)，以及MOG/抗-CD3/CD28的组合7天。7天后测定细胞因子。利用酶 联免疫吸附法测定IL-17A、IL-22和IFN-γ。
[0355] 结果
[0356] 图9表明从MS患者分离的PBMC在用白色念珠菌刺激后与对照相比产生更多的 IL-17A。当PBMC在单独暴露于MOG肽或抗-⑶3/⑶28后，观察到IL-17A增强。然而，在暴 露于抗-⑶3/⑶28和MOG肽后，MS患者产生强烈地增强的IL-17A浓度。与IL-17A -致， 显示当暴露于抗-⑶3/⑶28/M0G肽时IL-22 (Thl7相关的细胞因子）的浓度在来自MS患者 的PBMC中是提高的。有趣的是，当暴露于MOG肽、抗-CD3/CD28或这两种刺激物的组合时， 来自MS患者和健康个体的PBMC之间的IFN-γ产生是类似的。
[0357] 讨论
[0358] 结果表明，MS患者的PBMC清楚地不同地响应疾病特异性刺激物（M0G肽和 抗-CD3/CD28/M0G肽）。经由PBMC的IL-17和IL-22产生可以用于MS患者的分级，与IFN- γ 相反。
[0359] 实施例6
[0360] 材料和方法
[0361] 分级痛风患者。分析188位痛风患者其内在细胞因子产生能力。由于痛风是一种 IL-I疾病，我们测定了 PBMC在暴露于疾病特异性刺激物（单钠尿酸盐（MSU)晶体和脂肪酸 (C16.0))后的IL-I β产生。MSU是根据本领域技术人员已知的技术在我们的实验室制备。 C16.0 购自 Sigma Aldrich(USA)。将 PBMC 暴露于 MSU/C16.0(300 μg/ml，200 yM C16.0) 或 Pam3cys (10 μ g/ml) 24h。此后由 ELISA 测定 IL-I β。
[0362] 结果
[0363] 如图9所示，基于其在暴露于MSU/C16.0后的IL-Ιβ产生可以分级来自痛风患 者的PBMC。其显示，MSU和C16. 0 (棕榈酸）的组合对于产生IL-I β是重要的（10)。MSU 单独不刺激IL-I β的释放，C16.0也不能。非常有趣的，对于经由人PBMC的TNFa的产 生没有发现MSU/C16.0的协同作用。将共有188位痛风患者的组分级成低（<350pg/ml)， 中（>350〈2000pg/ml)和高（>200 Opg/ml)IL-10 产生者。当在 PBMC 的 Pam3cys 暴露后的 IL-Ιβ产生用于分类痛风患者时，其揭示了 Pam3cys诱导的IL-Ιβ产生与MSU/C16. 0产生 不相关。该后者表明MSU/C16. 0可以用作用于痛风患者分级的疾病特异性刺激物。
[0364] 讨论
[0365] 结果表明，痛风患者的PBMC清楚地不同地响应疾病特异性刺激物（MSU/C16. 0)。 如前所示的，参与痛风的经典细胞因子IL-I β的浓度在痛风患者中是增强的（9)。经由 PBMC的IL-I β产生可以用于痛风患者的分级。
[0366] 实施例7
[0367] 图5是由图4Α和4Β的数据作成。用大肠杆菌LPS或HK白色念珠菌（Candida albicans)刺激来自104位受试者的PMBC。通过暴露于10ng/ml大肠杆菌LPS或IO 6HK白 色念珠菌/ml 24h来测定TNFa产生能力。然后，使用ELISA测定TNFa。该图显示不是所 有受试者都显示为对于LPS和假丝酵母二者的高TNF a产生者。
[0368] 由Graphpad软件计算相关性并在图中示出。从图5中，可以看到相比于假丝酵母， 细胞因子响应不同于LPS。这意味着，TLR4和Dectin-1/MR-l的通路在每个个体中是不同 的。
[0369] 参考文献
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【主权项】
1. 一种用于在怀疑患有自身免疫和/或炎症性疾病或病症的受试者中评价促炎细胞 因子的抑制剂的效力的方法，其中所述促炎细胞因子选自由IL-1-β、IL-6、IL-17、IL-23、 IL-12、TNFa、IL-5和IFNγ所组成的组，并且所述方法包括下列步骤： (a)从所述受试者获得样品， (bl)用能够在所述样品中诱导促炎细胞因子产生的化合物接触所述样品，以及 (b2)用所述样品中所述促炎细胞因子的所述抑制剂与所述样品接触， (c) 在步骤（bl)和（b2)结束时确定所述促炎细胞因子在所述样品中的表达水平，以及 (d) 当在步骤（bl)结束时检测到所述促炎细胞因子的可检测表达水平或表达水平增 加时以及当在步骤（b2)结束时检测到所述促炎细胞因子的可检测的表达水平降低时，评 价所述促炎细胞因子的所述抑制剂的效力为足够的。2. -种优选根据权利要求1所述的方法，用于在受试者中评价B细胞的抑制剂的效力， 所述方法包括以下步骤： (a)从所述受试者获得样品， (bl)用能够在所述样品中诱导B细胞产生的化合物与所述样品接触，以及 (b2)用所述样品中所述B细胞的所述抑制剂与所述样品接触， (c) 在步骤（bl)和（b2)结束时确定所述样品中B细胞的数量，以及 (d) 当在步骤（bl)结束时检测到所述B细胞的可检测数量或数量增加时以及当在步骤 (b2)结束时检测到所述B细胞的可检测的数量减少时，评价所述抑制剂的效力为足够的。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法施用于以下自身免疫性和/或炎症 性疾病或病症和/或施用于以下促炎细胞因子和/或施用于以下B细胞标记物： i. RA和/或所述促炎细胞因子选自由TNFa、IL-1β、IL-6、IL-12、IL-17和IL-23所 组成的组和/或所述Β细胞标记物是⑶20和/或⑶19 ii. 另一种RA样疾病和/或所述促炎细胞因子是TNFα， iii. 溃疡性结肠炎和/或所述促炎细胞因子是TNFα， iv. 克罗恩氏病和/或所述促炎细胞因子选自由TNFα、IL-1β、IL-12、IL-17和IL-23 所组成的组， v. 银肩病和/或所述促炎细胞因子选自由TNFa、IL-12、IL-17和IL-23所组成的组， vi. MS和/或所述促炎细胞因子选自由IL-1β和IL-17所组成的组和/或所述细胞标 记物是⑶20和/或⑶19。 vii. 哮喘和/或所述促炎细胞因子选自由IL-5和IFNy所组成的组， viii. 败血症和/或所述促炎细胞因子选自由IL-Ιβ和IFNy所组成的组， ix. 痛风和/或所述促炎细胞因子是IL-1β， x. 莱姆病和/或所述促炎细胞因子选自由IL-1β和IL-17所组成的组， xi.II型糖尿病和/或所述促炎细胞因子选自由TNFα和IL-1β所组成的组。4. 根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中在步骤（bl)中能够在所述样品中诱 导促炎细胞因子产生的所述化合物是针对所述自身免疫和/或炎症性疾病或病症特异性 的。5. 根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述促炎细胞因子的表达水平通过 直接地定量所述促炎细胞因子的量和/或间接地通过定量编码所述促炎细胞因子的核苷 酸序列的量而确定。6. 根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中当在步骤（bl)之后的步骤（d)中评 价的所述促炎细胞因子的表达水平已增加至少20%以及在步骤（b2)之后的步骤（d)中评 价的所述促炎细胞因子的表达水平已减少至少10%时，促炎细胞因子的抑制剂的效力为所 述足够的。7. 根据权利要求1到6中任一项所述的方法，其中所述样品是获自所述受试者的流体。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述流体选自血液或脊髓液。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述流体是血液并包括PBMC。10. -种用于治疗怀疑患有自身免疫和/或炎症性病症或疾病的受试者的方法，包括 以下步骤：如在权利要求1到9中任一项所限定的在受试者中评价促炎细胞因子的抑制剂 的效力，以及随后如果所述抑制剂的效力是令人满意的，则用所述抑制剂治疗所述受试者。
【专利摘要】本发明涉及用于在受试者中评价促炎细胞因子抑制剂和/或B细胞抑制剂的效力的方法，以及用所述抑制剂治疗所述受试者的方法，条件是所述抑制剂的效力已被确定为足够的。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN105308460
【申请号】CN201480031642
【发明人】莱昂纳德斯·安东尼厄斯·贝尔纳杜斯·约斯滕, 米海·格奥尔基·纳特亚, 德 梅尔 约翰内斯·威廉·马尔藤·范
【申请人】天主教大学基金会
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2014年5月2日
【公告号】EP2992333A1, US20160077107, WO2014178715A1