一种监控γ-氨基丁酸生物转化过程的系统和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术制药领域，具体地涉及一种采用近红外技术监控γ-氨基丁 酸生物转化过程的系统和方法。
【背景技术】
[0002] γ_氨基丁酸（GABA)是一种不属于21种常见氨基酸的非蛋白质组成氨基酸。 γ-氨基丁酸作用于γ-氨基丁酸受体可引起细胞超极化，是中枢神经系统中最主要的抑 制性神经递质。据估计，30 %至40 %的中枢神经元可被γ-氨基丁酸所抑制，其主要具有延 缓神经细胞衰老、降低血压、修复皮肤机能、调节心律失常、治疗癫痫等生理功能。谷氨酸脱 駿酶（Glutamatedecarboxylase，GAD，CE4. 1. 1. 15)能在磷酸Ρ比咳酸辅酶的协助下，体内 催化谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸。因此谷氨酸脱羧酶是生物体内合成γ-氨基丁酸的关 键酶。
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[0004] 目前谷m酸脫羧_巳在细菌如大肠什菌、链球菌、黑曲莓、链抱莓等细菌中被发 现。同时，该酶还存在于植物如发芽糙米、矮茶番茄、大豆、桑叶，和哺乳动物的大脑组织中。 许多研究表明，γ-氨基丁酸是哺乳动物大脑和脊髓的主要的抑制性神经递质，能治疗帕金 森病、老年性痴呆、癫痫、阿尔茨海默病、僵人综合征和精神分裂症。研究发现每日口服米胚 芽（含有26. 4mgy-氨基丁酸）对治疗这些神经系统疾病非常有效。因此γ-氨基丁酸在 食品、医药保健、饲料加工领域都有广泛应用的前景，其市场的需求也越来越大。
[0005]中国专利（【申请号】201210464078Χ、2013101538534、2011100249468、 2014100146395、2012104899722、2009100405134、2012100636395、2007101299415)分别 公开了以米浆或发芽糙米、三七茎叶、茶叶、桑叶、绿藻以及大豆制品等为原料，制备富含 γ-氨基丁酸的产品与方法。但自然界的植物组织中γ-氨基丁酸含量低，将它高纯度地提 取出来是很困难的。目前制备高纯度的γ-氨基丁酸主要采用化学合成、微生物发酵和酶 法合成等方法。化学合成法具有反应条件剧烈、不易控制、成品粗糙不能应用于医药和饮食 等缺点。随着酶法转化技术的发展，人们开始了利用天然植物来源的谷氨酸脱羧酶来制备 γ-氨基丁酸。中国专利（【申请号】2013103335411、2013103334870、2009101691190)分别公 开了从葡萄、西瓜皮、番木瓜等植物组织中提取谷氨酸脱羧酶的方法，以及酶法生产γ-氨 基丁酸的方法。
[0006] -般认为由微生物发酵产生的含有γ-氨基丁酸的食品是安全、环保的，也为丰 富的γ-氨基丁酸产品的生产提供了新的可能性。目前，基于谷氨酸脱羧酶催化合成γ-氨 基丁酸是主要的生产方式。γ-氨基丁酸的主要产生菌是乳酸菌，包括短乳杆菌，植物乳杆 菌，副干酪乳杆菌等。中国专利（【申请号】2009101140164、2013104864747、2013105198813、 2008101069507、2010101670587、2013100451393、2012101366961、2012100039318、 2009101140183、2005100407589、2008100614192)公开了乳酸乳球菌、乳杆菌、肠球菌、唾液 链球菌、以及红色红曲霉等细胞酶法转化法生产γ-氨基丁酸的方法。
[0007] 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶是由6个相同亚基组成的寡聚酶，单个亚基分子质量为 52. 6kDa，每个亚基含有1分子辅酶磷酸吡哆醛。该酶对L-谷氨酸具有严格的底物专一性， 反应的最适pH为3. 8~4. 5。随着基因工程技术的发展，高效表达谷氨酸脱羧酶的酶法转 化技术缩短了转化时间，大大提高了γ-氨基丁酸的产量和谷氨酸转化率。中国专利（申 请号：2013105459086、2011102897963)公开了高产γ-氨基丁酸的重组谷氨酸棒杆菌、重 组大肠杆菌的构建方法和应用。此外，中国专利（【申请号】2013103317856)将两种谷氨酸 脱羧酶基因gadBl、gadB2构建共表达载体导入到谷氨酸生产菌中构建基因工程菌，利用基 因工程菌表达的谷氨酸脱羧酶将其自身积累的谷氨酸脱羧合成γ-氨基丁酸，大大提高了 糖酸转化率。
[0008] γ-氨基丁酸的紫外吸收很弱，这给直接准确测定转化液和提取液中的γ-氨基 丁酸含量带来较大困难。通常采用衍生化的层析、比色法和HPLC法进行测定，耗时较长。中 国专利（【申请号】2010105609130)公开了一种简便快速测定茶叶中γ-氨基丁酸的方法。 该发明利用不溶性聚乙烯吡咯烷酮去除茶叶中的茶多酚类物质，然后基于Berthelot反应 的分光光度法测定茶叶中γ-氨基丁酸含量。中国专利（【申请号】2011104363513)公开了 一种γ-氨基丁酸的高效液相色谱法，它首先将待衍生样品与NaH2C03和衍生试剂2, 4-二 硝基氟苯进行衍生化反应，再采用C1S柱对衍生产物进行高效液相分析，并在350nm处进行 紫外检测，测定样品中γ-氨基丁酸的含量。中国专利（【申请号】2009801132289)还提供 一种使用特异性γ-氨基丁酸转氨酶，以氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸作为辅酶，生 成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸使酶脱氢失活，电子载体作用于所生成的NADPH，使水 溶性甲臜染料发生颜色变化，通过间接的方法测定γ-氨基丁酸的含量。
[0009] 此外，中国专利（【申请号】2012101728271)还提供了一种生物转化反应中快速计 算γ-氨基丁酸生成量的检测装置，该装置包括：pH感应仪、数字转化仪、滴液瓶、控制仪和 反应器。其数字转化仪可记录添加酸的体积，控制仪可以设定反应pH值、添加酸的浓度两 个参数，由加酸体积经过程序计算可得γ-氨基丁酸生成量，并直接显示在控制仪上，间接 的测定生物转化过程中γ-氨基丁酸。
[0010]目前，测定γ-氨基丁酸含量的方法有比色法、电泳法、色谱法和氨基酸分析仪等 方法。比色法常用的方法是以苯酚和次氯酸钠溶液作为显色剂显色反应，用紫外可见分光 光度计在645nm波长处测定γ-氨基丁酸含量的方法法，此方法在不同条件（温度、pH值、 离子等）下，显色略有不同，同时需要避免氨和铵盐的干扰。电泳法是以纸为基板，在外加 电场的作用下，由于物质理化性质差异，从而达到分离的作用，此方法重现性不好，误差较 大，适合定性分析，不适合定量分析，且结果易受温度、pH值等条件的影响。色谱法则以高 效液相色谱为主，由于γ-氨基丁酸无紫外吸收，先需要邻苯二甲醛（0ΡΑ)、异硫氰酸苯酯 (PITC)、2,4 一二硝基氟苯（FDNB)等衍生化试剂进行柱前衍生才能检测，但是衍生物不稳 定或者易产生副产品影响检测结果，且此方法操作繁琐耗时，单个样品需要30min以上时 间才能检测出来。氨基酸分析仪法则由于没有直接测定γ-氨基丁酸的氨基酸分析仪，只 能通过测定L-谷氨酸含量，间接计算出γ-氨基丁酸含量，此方法还易受其他氨基酸的影 响。γ-氨基丁酸的标准化、市场化规范都需要快速、准确、简便的检测方法作为支撑，现今 这些检测方法仍需优化，这些方法要么易受条件影响，准确性较差，要么操作过程复杂且耗 时长而无法普及。
【发明内容】
[0011] 本发明的一方面是针对现有γ-氨基丁酸酶法转化生产过程中存在的难以在线 控制的问题，提供一种同时在线测定L-谷氨酸和γ-氨基丁酸的系统，该系统包括：
[0012] 发生酶促反应从而获得生物转化液的生物反应器；
[0013] 用于过滤来自生物反应器的转化液的过滤装置；
[0014] 对来自过滤装置的转化液进行检测的近红外光谱仪；
[0015] 使生物反应器中的转化液经由过滤装置连续地传送到近红外光谱仪的传送栗；以 及
[0016] 用于对近红外光谱仪所采集的近红外光谱信号进行处理和运算拟合，从而得到 γ-氨基丁酸及其底物L-谷氨酸含量的计算机数据处理系统。
[0017] 优选地，所述生物反应器具有搅拌装置和控温加热装置。