视黄醇结合蛋白检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是属于医学免疫领域，设及一种免疫检测试剂，进一步说，本发明设及视黄 醇结合蛋白检测试剂盒检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 黄醇结合蛋白（RBP)测定试剂盒，该产品用于体外定量测定人血清中视黄醇结合 蛋白含量，作辅助诊断用。RBP主要在肝脏合成，因此血清中RBP的降低和增加与肝脏疾病有 关，并受肝脏疾病的出现和严重程度的影响。在肝病，肝硬化及急、慢性肝炎的血清RBP水平 均显著降低。
[0003] RBP可作为肾小管损伤的早期诊断指标。视黄醇结合蛋白RBP尿中稳定性强，不易 分解，不受pH和血压干扰。在肾近曲小管损伤时，其尿排量明显增加，故尿中RB袖憧增加可 作为肾近曲小管损伤的标志物。当肾脏滤过功能降低时，血中RBP因胆积而显示浓度升高。 血液或尿液中的RBP浓度可W作为一种理想的肾功能指标应用于临床。
[0004] 诊断方法:RBP的测定一般采用RIA法、ELISA法与化1A法、乳胶免疫比浊法等，但在 临床上多采用乳胶免疫比浊法 血清(含RBP)+试剂(乳胶抗人RBP抗体)---抗原抗体复合物产生浊度变化，在一 定的波长下检测，其浊度的变化与其含量成正相关。
[000引目前抗体与乳胶的连接通常使用化学偶联法，其作为R2试剂，非常容易发生聚结， 使得试剂质量随着存放时间的延长而下降。使试剂的稳定性差。
【发明内容】
[0006] 本发明根据R2试剂稳定性不佳，提供了一种方法来克服现有技术的不足，使得其 保持质量稳定，提供了一种灵敏度高，稳定性好的视黄醇结合蛋白检测试剂盒。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案： 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒，所述的试剂盒包括试剂R1、试剂R2,所述的试剂R1为 适当的缓冲液； 所述的试剂R2是用视黄醇结合蛋白抗体致敏聚苯乙締胶乳颗粒置于缓冲液中，所述试 剂R2的制备步骤包括： 步骤（1):在带有簇基的聚苯乙締胶乳颗粒(胶乳）中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亚 胺化DAC)，得到激活的胶乳颗粒； 步骤(2):将步骤（1)激活的胶乳颗粒和视黄醇结合蛋白抗体混合，待反应结束后再加 入葡萄糖封闭胶乳微球上未反应的基团，得到偶联抗体的胶乳微球即视黄醇结合蛋白抗体 致敏聚苯乙締胶乳颗粒，置于缓冲液中。
[0008] 作为进一步优选:步骤(2)中视黄醇结合蛋白抗体致敏聚苯乙締胶乳颗粒在试剂 R2中的浓度为0.08~0.28克/100ml。
[0009] 作为进一步优选:所述试剂R1中的缓冲液为PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、棚酸盐缓 冲液、醋酸盐缓冲液、巧樣酸-憐酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氨盐缓冲液、2-吗嘟乙横酸(MES) 缓冲液缓冲液中至少一种。
[0010] 作为进一步优选:所述试剂R2中的缓冲液为PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、棚酸盐缓 冲液、醋酸盐缓冲液、巧樣酸-憐酸盐缓冲液、碳酸盐-碳酸氨盐缓冲液、2-吗嘟乙横酸(MES) 缓冲液缓冲液中至少一种。
[0011] 作为进一步优选:步骤（1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺:聚苯乙締胶乳颗粒的 重量比为0.5~5:100。
[0012] 作为进一步优选:所述视黄醇结合蛋白抗体包括多克隆抗体或单克隆抗体。
[0013] 作为进一步优选:所述步骤（1)中的聚苯乙締胶乳颗粒其平均粒径在0.01~0.2mm 之间。
[0014] 本发明所述试剂盒所采用的检测原理为胶乳增强免疫透射比浊法，其原理是视黄 醇结合蛋白抗体的胶乳颗粒，与视黄醇结合蛋白发生免疫反应后，形成聚集颗粒，在一定波 长下，通过测定聚集物形成所产生的浊度，即可测出视黄醇结合蛋白的含量。
[001引本发明的优点和有益效果： 1.本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成 本低的优点。
[0016] 2.本发明采用的视黄醇结合蛋白检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法使得视 黄醇结合蛋白的检测更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的自动生化分析仪，特别 是对急诊能实现快速定量检测。
【具体实施方式】
[0017] 下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不仅仅局限于W下实施例。
[001 引 本发明的试剂盒设及试剂的主要原材料如下： 1. 视黄醇结合蛋白抗体:多克隆抗体(市售）。
[0019] 2. 胶乳:本发明仅示例性的采用直径为80~200nm带簇基基团的聚苯乙締胶乳颗粒(市 售)进行实验。
[0020] 本实施例的主要试剂的配制如下： 试剂R1:含2.0 %阳G6000 (聚乙二醇6000)、95mmo 1/LNaCl的goods缓冲液，该试剂为无 色透明溶液。
[0021] 试剂R2:用抗人视黄醇结合蛋白抗体致敏粒径为120nm的聚苯乙締胶乳颗粒。该试剂为 乳白色溶液。具体步骤如下： 1. 取1ml (1 OOmg/ml)胶乳，用0.02M(mo 1 /L)，P册.0的MES溶液(2-吗嘟乙横酸缓冲液)洗 涂3次，超声分散； 2. 然后加入0.22ml用0.02M，P册.0的MES溶液新鲜配制的邸AC(配制的溶液中抓AC的浓 度为lOmg/ml)混合完全，室溫混和15min; 3. 然后用ο. 05M，p册.ο的MES溶液洗涂2次，ο. lM，pH7.5的憐酸盐溶液洗涂1次，超声分 散备用； 4. 取2ml抗体(2mg/ml)溶液，加入0.3ml用0.02M，pH7.5的憐酸盐溶液配制，室溫混合 15min, 5. 然后加入0.32ml 10 %BSA(小牛血清白蛋白）溶液，4°C混合4h; 6. 再加入0.4ml 10 %葡萄糖溶液，4°C混合过夜； 7. 然后用0.015M，pH7.5的甘氨酸溶液洗涂3次，再加入0.015M，pH7.5的甘氨酸溶液(含 1 % BSA，0.2 % NaN3，15% 庶糖，0.01 %邸 TA-Na2，0.01 %tr tonX-100 的甘氨酸缓冲液)至胶乳(结 合抗体W后的胶乳重量)终浓度为0.18 % (质量体积比即0.18克/100ml)。
[0022]实施例2