纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于电化学免疫传感器构建技术领域，具体设及一种WTi化纳米管复合材 料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法，该电化学免疫传感器可 用于检测α-甲胎蛋白。
【背景技术】
[0002] 准确、灵敏地检测与疾病相关的蛋白质对许多现代研究领域，包括生物化学、生物 医学W及临床诊断都至关重要。尤其是临床检测与肿瘤及传染病相关的蛋白质对疾病的早 期检测和可靠性预测至关重要。甲胎蛋白（曰-fetoprotein,AFP)是胚胎发育早期的一种主 要血清蛋白，在健康的成人体内，其值通常低于25 ng/ml，血清中甲胎蛋白的升高对原发性 肝癌诊断具有重要的意义。许多免疫分析法，包括巧光免疫分析、电化学酶免疫分析、化学 发光免疫分析、酶联免疫吸附法等均被广泛用于检测肿瘤标记物。在众多免疫分析法中，电 化学免疫分析法是最快速、有效和灵敏的分析方法。
[0003] 随着纳米科学与技术的飞速发展，各种各样的纳米材料，包括碳纳米材料、石墨締 纳米材料、量子点、贵金属等被广泛应用于免疫传感器中用来提高其分析性能。例如，Juan Tang等人用碳纳米颗粒修饰的仿生界面作免疫传感器探头，用不规则形状的金纳米颗粒 标记的HRP-anti-AFP作为示踪标记物，用来检测AFP，其线性范围为0.02 -4.0 ng/mL，检测 限为10 pg/mUGanesh K. Parshetti等人用金纳米/壳聚糖修饰玻碳电极，用哑铃形Au-Fe3化异质结构标记信号抗体Ab2，用来检测AFP，其线性范围为0.01-40ng/mL，检测限为 2.3 pg/mL。然而运些免疫传感器均存在线性范围较窄，检测限较高，稳定性较低等问题，因 此需要运用新技术、方法和材料来制备具有更好性能的免疫传感器。
[0004] 在众多纳米材料中，Ti〇2纳米管由于其比表面积大、机械稳定性好、合成方法简 便、环境友好性、无毒、管状结构W及优异的生物相容性等内在优点吸引了广泛的关注。然 而，由于Ti化纳米材料的表面惰性，很难将抗体、抗原直接负载于其表面。为克服运些缺点， 交联法、共价结合法W及包埋法等被用来在Ti化纳米材料上固定生物分子。更重要的是， Ti化纳米管从未在免疫分析中用作示踪标记物。
[000引BS3是一种双氨基交联剂，具有水溶性、非裂解性、膜不渗透性等特点，它含有一个 末端氨基反应基团（Sulfo-NHS醋基），可与任何含有伯胺基团的分子反应。因此，其广泛应 用于生物分子的交联。
[0006]蛋白A和蛋白G均可被用于定向负载抗体。Qiang Zhu等人用化fion修饰工作电极， 将Protein A吸附于电极表面用于负载捕获抗体Abl，用负载大量金纳米颗粒和簇基官能团 的石墨締片作为标记物来负载二抗@氧化还原探针，用于多路复用检测AFP、CEA和猪链球菌 2(SS2)。其中AFP的线性范围为0.016-50 ng/mL，检测限为5.4 pg/mLJeremy M. Fowler 等人也进行了一系列报道研究，他们用琉基化蛋白G为支架在免疫传感器表面定向负载更 高量的捕获抗体Abl，用于免疫分析测试。然而，由于蛋白G还能与IgG的Fab片段相结合，运 可能会破坏抗体的定向负载，从而导致干扰。运些缺点可W通过基因截断蛋白G而产生的蛋 白G/而得W解决，蛋白G/对IgG仍有亲和力，但是它缺少了白蛋白、Fab片段W及膜结合位 点。由于蛋白护只能结合IgG的Fc片段，因此它可W更有效地用于定向捕获抗体Abl，并使它 们的抗原结合位点暴露在外部来结合目标抗原。
[0007] 本发明分别通过水热法、化学氧化聚合法W及巧樣酸Ξ钢还原法最终合成出 GNPs-PANI-TNT复合材料，将其分散于壳聚糖溶液中并滴加在电极表面。WBS3为氨基交联 剂将蛋白G/共价结合在壳聚糖表面，用于定向负载捕获抗体AbUBS 3还被用于结合HRP和信 号抗体W制备示踪标记物。本发明克服了现有报道中出现的线性范围较窄，检测限较高W 及稳定性较差等缺点，目前还未见有相关报道。
【发明内容】
[0008] 本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种WTi化纳米管复合材料为定向负载 支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法，该电化学免疫传感器能够快速地测定 甲胎蛋白，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。
[0009] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 一种WTi化纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构 建方法，其包括如下步骤： ① GNPs-PANI-TNT复合材料的制备： Ti化纳米管的制备:将0.6 g Ti化纳米颗粒和120 mL、10 Μ的NaOH水溶液混合后，转 移至反应蓋中，120±5°C下水热反应48 h，弃去上清液，所得白色粗制品洗涂后，在60°C条 件下干燥2 h，备用，记为TNTs; 聚苯胺-Ti〇2纳米管复合材料的合成:将0.2660 g TNTs、8.57 mL 0.1 Μ苯胺盐酸液、 W及10 mL 0.1 Μ的盐酸混合，0-5°C冰浴下磁力揽拌30 minW获得均匀的分散液;然后 在2 h内加入8.57 mUO.l Μ的过硫酸锭盐酸液，所得溶液在冰浴下继续反应3 h，室溫静置 过夜，固液分离，所得沉淀物用去离子水洗涂至pH为7,60°C下干燥3 h后研磨成粉末，备 用，记为 PANI-TNT; 金纳米颗粒-聚苯胺-Ti〇2纳米管复合材料的制备：取18 mg PANI-TNT和18 mL超纯 水，混匀，在揽拌条件下加入1 mUO.Ol Μ的HAuCU溶液和1 mL、0.01 Μ的封端剂巧樣酸 Ξ钢溶液，然后在20 min内加入1血新制的0.1 Μ的NaBH4溶液，室溫下继续揽拌0.5 h后 静置过夜，离屯、分离，沉淀物洗涂后，60°C下干燥过夜，备用，记为GNPs-PANI-TNT; ② 标记信号抗体Ab2的制备： 氨基化Ti化纳米管的制备:将100 mg TNTs与20 mL乙醇、1 mL 28%氨水和4 mL 3-氨丙 基Ξ乙氧基硅烷(APTES)混合后，机械揽拌过夜W防止TNTs沉淀，离屯、分离，弃去上清液，所 得固体残留物洗涂、干燥后，室溫下储存备用，记为NH2-TNT; 辣根过氧化物酶I氨基化Ti化纳米管I信号抗体生物共辆体的制备:将2 mg BS3溶解在 0.5 mL、0.02 Μ的PBS缓冲液中获得溶液A，然后将3 mg N出-TNT分散于溶液A中，揽拌下加 入350化2 mg·血-1的辣根过氧化物酶(皿P)水溶液并在室溫下解育30 min,然后加入20 化含0.6 mg·血-1信号抗体Ab2的PBS缓冲液(0.02 M)，4°C下揽拌4 h，离屯、分离，所得沉淀 物用PBS缓冲液洗涂并用含2%牛血清蛋白的PBS缓冲液在室溫下封闭30 min,最后用PBS缓 冲液洗涂后，分散于含0.1%牛血清蛋白的1.0 mL PBS缓冲液中，备用，记为皿PIN此-TNTI Ab2； ③免疫传感器的构建： 首先，将5 mg步骤①所得GNPs-PANI-TNT分散于1 mL含0.2%壳聚糖的HAc溶液中，超 声20 minW得到均匀的分散液，取5化分散液滴加在预处理好的玻碳电极表面，室溫下自 然惊干;然后在玻碳电极表面滴加10化含2 mg·血-iBS3的PBS缓冲液(0.02 M)并在室溫 下解育1 h，随后滴加10化1 mg· m[i的蛋白护，室溫下解育60 min,浸入PBS缓冲液中洗 涂3 min,然后将该玻碳电极用5化封闭缓冲液解育30 min,再分别用洗涂缓冲液(PBST)和 PBS缓冲液洗涂3 min,最后将5化0.44 mg· ml/i的捕获抗体Abl滴加在该玻碳电极表面， 室溫下解育1 h，再在4°C、100%湿度饱和环境下解育过夜后，分别用洗涂缓冲液和PBS缓冲 液洗涂，即得电化学免疫传感器。
[0010] 具体的，步骤②中，所述洗涂缓冲液(PBST)为:含0.05 %(w/v)Tween 20的PBS缓冲 液(0.05 M, pH 7.4); 步骤③中，所述封闭缓冲液为:含5 %(w/v)牛血清蛋白（BSA)的PBS缓冲液(0.05 M，pH 7.4)。
[0011] 和现有技术相比，本发明方法发明的有益效果： 在电极表面引入GNPs-PANI-TNT复合材料，增加了该免疫传感器的导电性和生物相容 性。通过滴加 Protein 能定向负载Abl，提高Abl的结合效率。同时，与Protein A相比， Protein护有更广泛的适用性和更高的定向捕捉抗体能力。利用Ti化纳米管比表面积大、 生物相容性好的优点，借助BS3将酶和抗体固定在氨基化Ti化纳米管表面用作免疫示踪标记 物，可提高酶和抗体的负载量，从而提高该传感器的灵敏度和检测限。
【附图说明】
[001引图1为不同材料的测试图谱，其中，A为TNTs的SM图，B为TNTs的??Μ图，C为PANI-TNT的SEM图，D和E分别为GNPs-PANI-TNT复合材料、及其局部放大的沈Μ图，F为GNPs-PANI-TNT复合材料的邸X图； 图2为不同材料的XRD图谱，其中，a为TNTs，，b为PANI，C为GNPs-PANI-TNT; 图3为不同材料的FT-IR图谱，其中，a为TNTs，b为畑2-TNT，c为PANI，d为GNPs-PANI- TNT； 图4为奈奎斯特图，其中，a为裸GCE，b为GNPs-PANI-TNT I壳聚糖，C为GNPs-PANI-TNT I壳 聚糖I蛋白G/，d为GNPs-PANI-TNT I壳聚糖I蛋白护| BSA，e为GNPs-PANI-TNT I壳聚糖I蛋白 G'l BSAI Abl，f 为GNPs-PANI-TNT I 壳聚糖 I 蛋白 G'l BSAI Abl IAFPI Ab2 修饰的 GCE; 图5为测试溶液的pH值对本发明免疫传感器电流响应的影响； 图6为培育时间对本发明免疫传感器电流响应的影响； 图7为还原峰电流随AFP浓度增加的变化曲线； 图8