242 cnfi处的峰属于C-N+'伸缩振动峰，运再次证明了ES-PANI的存在。GNPs-PANI-TNT 展示了PANI的特征吸收峰口00-1600 cnfi)W及Ti-0-Ti和Ti-0的振动吸收带(400-700 cm -1)(曲线d)。正如预期的那样，GNPs没有产生明显的FT-IR吸收峰。然而，Ξ元复合材料的形 成导致了PANI特征吸收峰位置的偏移，其中1563，1474，1299和1125 cnfi (曲线b)的 吸收峰分别移动至1580，1497，1309和1147 cnfi(曲线C)。运些位移是由PANI和TNTs之 间强烈的相互作用引起的。
[0022] 电化学阻抗(EIS)法监测免疫传感器的组装过程： 电化学阻抗图谱(EIS)是用来评估动力学过程和修饰电极界面性能的有效工具。因此， 电化学阻抗被用来探测本发明实施例1所制备得到的用W检测AFP的电化学免疫传感器的 组装过程。
[0023] 阻抗实验在含0.1 Μ电解质KC1的5 mM K3[Fe(CN)6] |K4[Fe(CN)6]中进行，并在 0.209 V的直流电压上叠加5 mV的交流电压。在100 K化~100 mHz频率范围内记录奈奎斯 特图，如图4所示。图4中的所有奈奎斯特图在高频区呈现一个半圆，它对应电子转移电阻 (Ret);在低频区包含一个直线部分，它对应扩散控制过程。半圆直径与修饰电极表面的铁氯 化钟电子传递系数成反比。纳米材料和生物分子的附着形成了一个电子和传质阻挡层，它 阻碍铁氯化钟向电极表面的扩散，因而减小了电子传递系数。如预料那样，裸GCE电极（曲线 a)有一个很小的半圆，它代表表面电阻很小，对应扩散控制过程。在曲线b-f中，裸GCE电极 依次被修饰上GNPs-PANI-TNTi壳聚糖分散体系、蛋白护、BSA、捕获抗体Abl和信号抗体Ab2， 从图中可W看出，伴随着逐步修饰过程，半圆直径逐渐增加，表明各种材料被层层组装于电 极表面。
[0024] 电化学免疫传感器检测条件的优化： 测试溶液的pH值是影响酶传感器性能的一个重要因素，因为强酸和强碱环境均会破坏 生物分子的活性。溶液抑对免疫传感器电流响应的影响如图5所示。电流响应值在抑4.0- 7. ο范围内随着pH值的增加而快速增加，当pH超过7. ο后，开始减小。因此，含ο. 10 Μ的ο. 05 Μ pH 7.0 PBS缓冲液被选作检测液用于检测AFP。
[002引 AFP在GNPs-PANI-TNT惊聚糖愼白GMBSAlAbl上的培育时间是影响免疫传感器 分析性能的另一个重要因素。在室溫下，AFP免疫传感器的电流响应值随AFP培育时间的增 加而显著增加，超过50 min后基本达到一个恒定值(如图6所示），运表明AFP与电极表面的 捕获抗体Abl的结合达到饱和。因此，将50 min选作此夹屯、型免疫分析的培育时间。
[0026] 分析性能评估： HRP由于其稳定性、高催化性W及超高灵敏度，成为电化学免疫分析中广泛研究的示踪 酶。在运里，本发明通过双氨基化试剂BS3将HRP和捕获抗体负载于Ti化纳米管表面形成了免 疫分析的示踪标记物。实验前，检测液用高纯氮气除氧15 min,在检测过程中保持氮气环 境。在出化的帮助下，HRP催化氨酿转化为苯酿，随后苯酿被电化学还原为氨酿来提供检测信 号，如下两反应式所示：
[0027] 在最优条件下，差分脉冲伏安(DPV)被用来评估免疫传感器的分析性能。如图7所 示，还原峰电流随AFP浓度的增加而增加，校准曲线（图7中的插图）显示峰电流与分析物浓 度的对数之间有良好的线性关系，线性范围为0.01 ng/mL至350 ng/mL，相关系数为 0.994(n=4).在信噪比为3的条件下，AFP的检测限低至1.5 pg/mL，运不仅低于之前报道的 多种免疫分析方法，还低于那些具有放大策略的免疫传感器。
[0028] 免疫传感器的重现性、特异性、稳定性和在血清样品中的应用 本发明进一步研究了实施例1制备所得夹屯、型电化学免疫传感器的特异性、重现性和 稳定性。为评估该免疫传感器的特异性，本发明引入了几种可能的干扰物，包括癌胚抗原 (CEA)，前列腺癌蛋白抗原(PSA)，肿瘤抗原125(CA125)，免疫球蛋白G(IgG)和牛血清蛋白 (BSA)。此免疫传感器分别用含有上述其中一种干扰物（100 ng · mL-i)的5 ng · mL-i AFP解 育。如图8所示，与没有干扰物相比，由干扰物引起的电流变化小于5%，运表明此免疫传感器 具有良好的选择性。
[0029] 为了探究此免疫传感器的准确度和重现性，本发明用相同样品分别制备五根电极 在相同条件下进行研究测试，所得相对标准偏差(RSD)为5.2%。表明此免疫传感器准确度 和重现性良好。
[0030] 此外，此免疫传感器的稳定性也通过测量它们在4°C条件下储存3周前后的电流响 应进行了评估。结果表明，3周后92.1%的电流响应得W保留，运表明此免疫传感器具有良好 的稳定性。
[0031] 该免疫传感器对实际血清样品分析的适用性通过标准加入法进行了评估。实验结 果显示在表1中。回收率/检测率为96.4% - 106.0%，运表明本发明的电化学免疫传感器可 被用于日常临床诊断中人体血清中AFP的检测。
[0032] 表1用本发明免疫传感器检测加入人体血清中的AFP(n=3)
【主权项】
1. 一种以Ti〇2纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构 建方法，其特征在于，包括如下步骤： ①GNPs-PANI-TNT复合材料的制备： Ti02纳米管的制备:将0.6gTi02纳米颗粒和120mL、10Μ的NaOH水溶液混合后，转 移至反应釜中，120±5°C下水热反应48h，弃去上清液，所得白色粗制品洗涤后，在60°C条 件下干燥2h，备用，记为TNTs; 聚苯胺-Ti02纳米管复合材料的合成:将0.2660gTNTs、8.57mL0.1Μ苯胺盐酸液、以及10mL0.1Μ的盐酸混合，0-5°C冰浴下磁力搅拌30min以获得均匀的分散液;然后在2 h内加入8.57mL、0.1Μ的过硫酸铵盐酸液，所得溶液在冰浴下继续反应3h，室温静置过 夜，固液分离，所得沉淀物用去离子水洗涤至pH为7,60°C下干燥3h后研磨成粉末，备用， 记为PANI-TNT; 金纳米颗粒-聚苯胺-Ti02纳米管复合材料的制备:取18mgPANI-TNT和18mL超纯水， 混匀，在搅拌条件下加入1mL、0.01Μ的HAuCl4溶液和1mL、0.01Μ的封端剂柠檬酸三 钠溶液，然后在20min内加入1mL新制的0.1Μ的NaBH4溶液，室温下继续搅拌0.5h后静 置过夜，离心分离，沉淀物洗涤后，60°C下干燥过夜，备用，记为GNPs-PANI-TNT; ② 标记信号抗体Ab2的制备： 氨基化Ti〇2纳米管的制备:将100mgTNTs与20mL乙醇、1mL28%氨水和4mL3-氨丙 基三乙氧基硅烷混合后，机械搅拌过夜以防止TNTs沉淀，离心分离，弃去上清液，所得固体 残留物洗涤、干燥后，室温下储存备用，记为NH2-TNT; 辣根过氧化物酶I氨基化Ti02纳米管|信号抗体生物共辄体的制备:将2mgBS3溶解在 0.5mL、0.02Μ的PBS缓冲液中获得溶液A，然后将3mgNH2-TNT分散于溶液A中，搅拌下加 入350yL2mg·ml/1的辣根过氧化物酶水溶液并在室温下孵育30min，然后加入20yL含 0.6mg11/1信号抗体Ab2的PBS缓冲液，4°C下搅拌4h，离心分离，所得沉淀物用PBS缓冲液 洗涤并用含2%牛血清蛋白的PBS缓冲液在室温下封闭30min，最后用PBS缓冲液洗涤后，分 散于含0.1%牛血清蛋白的1.0mLPBS缓冲液中，备用，记为HRP|NH2-TNT|Ab2; ③ 免疫传感器的构建： 首先，将5mg步骤①所得GNPs-PANI-TNT分散于1mL含0.2%壳聚糖的HAc溶液中，超 声20min以得到均匀的分散液，取5yL分散液滴加在预处理好的玻碳电极表面，室温下自 然晾干;然后在玻碳电极表面滴加10yL含2mg·ml/1BS3的PBS缓冲液并在室温下孵育1 h，随后滴加10yL1mg.mL-1的蛋白G、室温下孵育60min，浸入PBS缓冲液中洗涤3min， 然后将该玻碳电极用5yL封闭缓冲液孵育30min，再分别用洗涤缓冲液和PBS缓冲液洗涤3 min，最后将5yL0.44mg.1111/1的捕获抗体Abl滴加在该玻碳电极表面，室温下孵育1h， 再在4°C、100%湿度饱和环境下孵育过夜后，分别用洗涤缓冲液和PBS缓冲液洗涤，即得电化 学免疫传感器。2.如权利要求1所述以Ti02纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免 疫传感器的构建方法，其特征在于，步骤②中，所述洗涤缓冲液为：含0.05 %Tween20的 PBS缓冲液； 步骤③中，所述封闭缓冲液为:含5 %牛血清蛋白的PBS缓冲液。
【专利摘要】本发明涉及一种以TiO2纳米管复合材料为定向负载支架和示踪标记物的电化学免疫传感器的构建方法，其分别通过水热法、化学氧化聚合法以及柠檬酸三钠还原法最终合成出GNPs-PANI-TNT复合材料，将其分散于壳聚糖溶液中并滴加在电极表面。以BS3为双氨基交联剂将蛋白G′共价结合在壳聚糖表面，用于定向负载捕获抗体(Ab1)。BS3还被用于结合辣根过氧化物酶（HRP）和信号抗体（Ab2）以制备示踪标记物。采用本发明方法制备所得的电化学免疫传感器能够快速的测定α-甲胎蛋白AFP，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。
【IPC分类】G01N33/58, G01N33/543, G01N27/327, G01N33/68
【公开号】CN105486873
【申请号】CN201510893519
【发明人】刘小强, 霍小鹤, 刘培培, 朱杰
【申请人】河南大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月8日