人抗苗勒氏管激素胶体金免疫层析检测试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及胶体金免疫层析快速检测领域，具体涉及一种人抗苗勒氏管激素胶体金免疫层析检测试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]抗苗勒氏管激素(AMH)作为一种新型的评估女性卵巢功能的指标，相比于滤泡刺激素(FSH)水平、抑制素B(INH)水平和宼卵泡的数目等传统的评价女性卵巢功能的指标，AMH在检测者月经周期中保持恒定，血清AMH的水平不会随着性腺激素的波动而变化，因此AMH的检测不受女性月经周期的制约，可以随时检测，解决了目前妇产生殖科面临的主要问题之一。AMH是一种由两个相同的70KD亚基通过二硫键形成的二聚体糖蛋白，AMH在女性体内由卵巢中颗粒细胞直接分泌，是女性早期卵泡的直接产物，浓度最高为窦腔小卵泡和窦前卵泡时期，而在大卵泡时期，AMH的表达逐渐下降。苗勒氏管作为输卵管、子宫和大部分阴道的起源，AMH在女性中持续存在，其浓度水平可以反映整个生命周期中卵泡的活性，可明确得知卵巢的储存量。女性随着年龄的增加，卵巢功能下降，血清AMH水平也逐渐下降，AMH被认为是最早揭示这一生理现象的指标，现今已成为一项预测女性卵巢储备能力的重要指标。大量研究表明，血清AMH浓度水平检测，除了预测女性生殖能力，辅助女性规划生殖的作用以外，还有助于提高辅助生殖技术中促排卵方案的成本效益，并与体外授精联合胚胎移植技术中的临床妊娠率和活产率息息相关。
[0003]根据上述这些优势，欧美国家近年来临床上逐步开始使用AMH血清浓度水平来评估女性的卵巢功能。常规的欧美检测方法为酶联免疫检测AMH试剂盒的方法，但其耗时长、灵敏度低、背景值高、易造成假阳性和假阴性结果，并且需要专业人员进行实验操作。因此目前逐步用化学发光等方法替代，但是这类方法，譬如罗氏的ELECSYS AMH检测仪等，仍为非开放系统，价格昂贵，且需要专门培训仪器使用人员，维修及检测成本均高，并不适于推广使用。上述均为欧美国家主要的检测AMH的方法，目前我国国内并无自主知识产权的检测AMH的试剂盒，主要均依赖进口，而进口的这些试剂价格昂贵，均需要专业技术人员进行操作，检测复杂费时，不利于AMH检测在国内的广泛开展。
[0004]目前我国已开放二胎政策，且体外授精等技术在我国得到一定的推广，因此需要判定卵巢水平并进行备孕的女性数量激增，然而我国尚无自主知识产权的AMH临床诊断试剂盒，目前主流使用的AMH检测试剂盒主要依赖于进口，并不适合于推广使用。胶体金免疫层析法是一种对复杂样品中目标物质进行检测的固相免疫分析方法，其主要原理如下:利用胶体金标记一种抗体或者抗原，与目标物质反应形成复合物，由于毛细管作用在固相层析膜上涌动，被检测线上的抗体或者抗原捕获，形成肉眼可见的T线。一定条件下，T线信号强弱与目标物质浓度正相关，将胶体金免疫层析检测试纸条联合胶体金读取仪的方法，根据反射光度法原理，可以快速、准确、简单的对相关物质进行定量或者半定量检测，目前已广泛应用于HCG、MAU等人体代谢物的定量检测，成为一种主流的即时检验(Point-of-caretest ing，P0CT)方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种人抗苗勒氏管激素胶体金免疫层析检测试剂盒及方法，由此快速即时检测卵巢功能，通过胶体金免疫层析定量检测的方法，检测女性血清中AMH的浓度，从而用于评估女性卵巢中卵子的活性以及储存量，准确，快速，灵敏度高，无需专业人员操作，成本较低，便于推广使用。
[0006]为达到上述目的，本发明采用第一技术方案:一种人抗苗勒氏管激素胶体金免疫层析检测试剂盒，其包括:试剂卡壳、设置在试剂卡壳内的底板、设置在底板一端的样本垫、一端与样本垫抵靠接触的胶金垫、一端与胶金垫另一端抵靠接触的检测垫、以及与检测垫另一端接触的吸收垫，其中胶金垫上包含胶体金纳米颗粒以及结合了鼠抗人AMH的第一抗体，而检测垫上分布了不重合的检测线和质控线，其中检测线上包含了鼠抗人AMH的第二抗体，质控线上包含了抗第一抗体的第三抗体。
[0007]在第一技术方案的基础上，进一步包括如下附属技术方案:
[0008]所述第二抗体为只有在有AMH存在的情况下才和AMH及第一抗体特异性结合，而第三抗体在任何情况下都能和第一抗体结合。
[0009]所述样本垫和胶金垫至少部分重叠，而胶金垫和检测垫至少部分重合。
[0010]所述胶体金粒径为lO-lOOnm，且胶体金颗粒的制备使用恒温回流加热法，优选采用油浴恒温回流加热的制备方法，粒径均一稳定，大小可控。
[0011 ]其还包含胶体金读取仪，且胶体金读取仪的光密度扫描波长在450-550nm之间。
[0012]所述检测线靠近胶金垫一端，所述质控线靠近吸收垫一端，所述检测线和质控线相隔距离在0.5-1.5cm之间。
[0013]所述卡壳包括相互匹配并扣合的上下半卡壳，所述卡壳具有加样孔和观察孔，加样孔位于胶金垫和样本垫处并局部裸露样本垫，而观察孔位于检测垫上方并裸露检测线和质控线。即加样孔在卡壳上方有一定开口可以暴露出样本垫，而卡壳的观察孔位于检测垫上方有一定开口可暴露出检测线和质控线。
[0014]进一步的，女性血清样本加样15min后，胶体金免疫层析试剂盒结合胶体金读取仪检测血清样本中含有的AMH的浓度水平。
[0015]进一步的，所述胶体金读取仪采用胶体金免疫层析定量读取仪，属于一种由光、机、电组成的精密仪器，扫描读取检测线和质控线的信号强度值，将信号强度值通过光电及模/数转换，转为数字信号，内置优化好的AMH光度-浓度标准曲线，数字信号在标准曲线中计算后，获得所检测得到的浓度值。所述胶体金读取仪扫描检测线与质控线时，吸收光扫描范围根据胶体金粒径大小，光密度扫描波长在450-550nm之间。
[0016]进一步的，所述AMH浓度-光度标准曲线，采用60岁以上妇女血清做阴性血清，人AMH抗原标准品购买自可溯源的商业化抗原，使用阴性血清做稀释液混合AMH标准品测定胶体金免疫层析试纸条检测线信号值，并根据信号值与浓度关系绘制光度-浓度标准曲线。
[0017]进一步的，分别调整反应中所述的第一抗体标记到ImL胶体金上的方法，pH值6-9之间、第一抗体蛋白量位5_15yg、BSA添加量为l-10mg、PEG添加量为l-10mg，分别调整了检测线上第二抗体的浓度，质控线上第三抗体的浓度，并调整金标第一抗体在胶金垫上的用量。
[0018]进一步的，其还包括抗体稀释液:0.0lM的磷酸缓冲溶液;胶金垫处理缓冲溶液:pH8.5,0.1M且含I % BSA (牛血清白蛋白)，0.5 %的Tween-20 (吐温20)的Tris-HCl (三氨基甲烷-盐酸)缓冲溶液;AMH标准品稀释液:65岁以上女性阴性血清样品。
[0019]为达到上述目的，本发明采用第二技术方案:一种人抗苗勒氏管激素胶体金免疫层析检测试剂盒的方法，其包括:
[°02°] S1、制备胶体金纳米颗粒步骤；
[0021 ] S2、胶体金标记抗人AMH抗体的制备步骤；
[0022]S3、胶金垫的处理步骤；
[0023]S4、样本垫的制备步骤；
[0024]S5、检测垫上检测线及质控线的包被步骤；
[0025]S6、人AMH胶体金免疫层析定量检测试剂盒的组装步骤。
[0026]在第二技术方案的基础上，进一步包括如下附属技术方案:
[0027]S1、制备胶体金纳米颗粒步骤:将氯金酸溶液还原成粒