液即可。
[0060]其中，准确称量5mg的[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷，用甲醇溶解定容至10mL后得到 浓度为49.55yg/mL的内标物储备液，内标物储备液经甲醇稀释至0.99 lyg/mL得到内标物工 作液D;内标物储备液和内标物工作液D均于-20°C下保存。
[0061 ] 有益效果：
[0062] 与现有技术相比，本发明高效稳定，回收率和稳定性良好(批内精密度在3.63%~ 6.39 %之间，批间精密度在3.88 %~9.35 %之间，批内和批间RSD均在10 %以内，平均回收 率在91.90 %~116.76 %之间），具有准确、简便、经济、高效等优点，适于临床检测中推广应 用。
【附图说明】
[0063] 图la为标准品中8-羟基脱氧鸟苷定量离子对的选择离子流色谱图；
[0064] 图lb为标准品中8-羟基脱氧鸟苷定性离子对的选择离子流色谱图；
[0065] 图lc为标准品中8-羟基鸟苷定量离子对的选择离子流色谱图；
[0066] 图Id为标准品中8-羟基鸟苷定性离子对的选择离子流色谱图；
[0067] 图le为标准品中[13C，15N2]-8_羟基脱氧鸟苷的选择离子流色谱图；
[0068] 图If为标准品中[13C，15N2]-8_羟基脱氧鸟苷的选择离子流色谱图；
[0069] 图2a为尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷定量离子对的选择离子流色谱图；
[0070] 图2b为尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷定性离子对的选择离子流色谱图；
[0071 ]图2c为尿液样品中8-羟基鸟苷定量离子对的选择离子流色谱图；
[0072]图2d为尿液样品中8-羟基鸟苷定性离子对的选择离子流色谱图；
[0073]图2e为尿液样品中[13C，15N2]-8_羟基脱氧鸟苷的选择离子流色谱图；
[0074]图2f为尿液样品中[13C，15N2]-8_羟基脱氧鸟苷的选择离子流色谱图。
【具体实施方式】
[0075]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0076] 实施例1
[0077] 1、材料
[0078] 方法学研究实验的样本来自于上海迪安医学检验所员工的尿液样本。
[0079] (1)仪器：LC-20AD液相色谱仪（岛津，日本）、API4000+三重四极杆质谱仪（AB Sciex，美国）、优普超纯水机(超纯，成都）、多管涡旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司）；快速 混勾器(新康，江苏）、高速冷冻离心机（白洋，北京）、色谱分离柱为Ultimate Polar-RP3ym 2.1X100、可调移液器（ThermoFisher，0.5 ~10yL，10 ~100yL，100 ~1000yL)和玻璃仪器、 烧杯、量筒等。
[0080] (2)试剂耗材：甲醇、乙腈均为色谱纯，购自美国天地公司；甲酸为色谱纯，购自天 津市致远化学试剂有限公司；1.5mL离心管(AXYGEN，美国）；二水合氯化钙、六水合氯化镁、 氯化钠、硫酸钠、柠檬酸钠二水合物、草酸钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化铵、尿素、肌酐等均 购自国药集团化学试剂有限公司。
[0081 ] (3)标准品:8-羟基脱氧鸟苷(纯度96 % )、8-羟基鸟苷(纯度97 % )以及同位素内标 物[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷（纯度99 · 1 % )购自加拿大Toronto Research Chemical公司。
[0082] (4)质控品：含有8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液，分高中 低三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表1所示。
[0083] 表1 8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷质控品对应浓度(单位ng/mL)
[0084]
[0085] 2、方法
[0086] (1)色谱条件
[0087] 流动相A: 0.1 % (v/v)的甲酸水溶液;流动相B:乙腈。流速为0.4mL/min色谱柱为 Ultimate Polar-RP，2.1 X 100_，3μηι，柱温30°C，进样量为10yL，采用梯度洗脱方式，具体 参数见表2。
[0088] 表2液相梯度洗脱参数
[0089]
[0090] (2)质谱条件:采用电喷雾离子源(Electrospray Ionization，ESI)和多反应监测 (Multiple Reaction Monitoring，MRM)模式进行质谱扫描。离子源参数:加热气(GS1)和辅 助加热气(GS2)均为65psi，脱溶剂气温度为550°C;气帘气(Curtain Gas，CUR)为50psi，碰 撞气(Collision Gas，CAD)为5psi ;喷雾针（Ionspray，IS)电压为5500V。目标物8-羟基脱氧 鸟苷定量离子对和定性离子对分别为m/z 284.2> 168.2和m/z284.2> 140.2，8-羟基鸟苷定 量离子对和定性离子对分别为m/z 300.1>140.1和m/z300.1>168.1，内标物监测离子对为 m/z 287.2> 171.2和m/z 287.2>143.2。为了获取较好的稳定性和灵敏度，各化合物监测离 子对的去簇电压(Declustering Potential，DP)和碰撞电压(Collision Energy，CE)等参 数均经过系统优化，具体参数见表3。
[0091] 表3 8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和内标物质谱多反应监测离子通道参数
[0092]
[0093]注:a为定量离子对，定性离子对。
[0094] (3)空白人工尿液基质配制：分别取0.5586g二水合氯化钙、0.6099g六水合氯化 镁、4 · 2077g氯化钠、2 · 0596g硫酸钠、0 · 6470g柠檬酸钠二水合物、0 · 020 lg草酸钠、2 · 5449g 磷酸二氢钾、1.4388g氯化钾、0.9200g氯化铵、2.4985g尿素、1.0520g肌酐用去离子水溶解 并定容至1L。
[0095] (4)标准品配制：用甲醇将质量均为5mg的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷标准品分 别定容至10mL，配置成浓度分别为0.48mg/mL和0.485mg/mL的储备液A、B，-20°C保存。取A、B 储备液各100yL经甲醇稀释后定容至10mL，配置成浓度分别为4.8yg/mL和4.85yg/mL的混合 标准液C1，-20°C保存。取100yL混合标准液C1用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，得到 浓度分别为96ng/mL和97ng/mL的混合标准液C2，然后取500yL混合标准液C2经空白人工尿 液基质稀释定容至5mL配制成浓度分别为9.6ng/mL和9.7yg/mL的混合标准液C3。用甲醇将 质量为0.5mg的内标物溶解后定容至10mL，得到浓度为49.55yg/mL的内标物储备液，储备液 经甲醇稀释至〇.991yg/mL作为内标物工作液D，储备液和工作液均于-20°C保存。
[0096] (5)质控品配制:分别取1 OyL、60yL、120yL混合标准品C1用空白人工尿液基质定容 至10mL。
[0097] 分析试剂盒中各组分见表4。
[0098] 表4 8-羟基脱氧鸟苷及8-羟基鸟苷分析试剂盒组分的制备
[00991
[0100] (6)样品处理
[0101] I校准点处理:分别移取混合标准液C2 25μ1、50μL、100μL用空白人工尿液基质定 容至100yL作为标准校准点35、36、37;分别取5以1^、1(^1^、5(^1^、10(^1^混合标准液03用空白人 工尿液基质定容至l〇〇yL，得到标准校准点SI、S2、S3、S4，这7个浓度点体积均为100yL，其中 SI、S2、S3、S4、S5、S6、S7作为8-羟基脱氧鸟苷的校准点，S2、S3、S4、S5、S6、S7作为8-羟基鸟 苷的校准点。接着向其中各加入15yL0.991 yg/mL内标物工作液D，混匀后用甲醇定容至 〇.5mL，然后涡旋20秒后振荡lOmin，于4下12000g离心5min后取10yL上清液进HPLC-MS/MS分 析。
[0102] Π 尿液样品前处理:取尿液1 OOyL至1.5mL离心管中，加入15yL内标液D后混匀，再 用甲醇定容至〇. 5mL，漩涡振荡lmin，于4°C 12000g离心5min，取上清10yL进HPLC-MS/MS分 析。
[0103] m质控品前处理:分别取质控品溶液QC(L)，QC(Μ)，QC(Η)各100yL于1.5mL离心管 中，其它同尿液样品前处理方法一致，此处不再赘述。
[0104] 3、方法的建立与优化
[0105] 为了达到更高的稳定性和灵敏度，实验采用MRM模式同时监测8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷以及[13C，15N 2]-8-羟基脱氧鸟苷的离子对(Q1/Q3)，使用"Ramp"对不同离子对的去 簇电压(Declustering Potential，DP)和碰撞电压（Collision Energy，CE)等参数进行了 系统优化，从优化色谱图中即可看到离子最高信号强度所对应的最佳结果，记录优化结果 见表5。此外，其它参数如15、040、〇]1?、651和652等根据仪器提供的参考值范围选择合适的 数值，以保证稳定的信号强度。
[0106] 表5 8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷及[13C，15N2]-8_羟基脱氧鸟苷质谱参数优化结 果
[01071
[0108] 4、方法验证
[0109] (1)选择离子流图：标准品和尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷、8-羟基鸟苷和[13C， 15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的选择离子流色谱图（XIC)见图1和图2,标准品中8-羟基脱氧鸟苷和 8-羟基鸟苷浓度均为25ng/mL，而尿液样品中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷浓度分别为 9.33ng/mL和12.3ng/mL，无论是标准品还是尿液样品均无杂峰干扰，说明该方法条件切实 可行，能够满足检测要求。
[0110]