高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生化检测领域，具体涉及一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿 液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒。
【背景技术】
[0002] DNA和RNA氧化损伤应激产物作为生物标记物的潜在用途和价值是生物医学研究 的一个重要方面。8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷作为两种重要的氧化标记物，在组织细胞 内产生，经血液运输，由肾脏随尿液排出体外。由于两种物质在体内较为稳定，且尿液样本 易得，可以实现无创检测，通过对尿液中两种物质的监测可以为有效评价机体各种因素引 起的氧化损伤提供帮助。此外，通过对健康人体内两种生物标记物的含量检测，可以评估性 另IJ、年龄和吸烟等潜在因子的影响作用。因此，开发一种经济、高效的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷检测方法至关重要。
【发明内容】
[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液 中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试剂盒，以解决现有技术存在的特异性较差和灵敏度低 的问题。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0005] 高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的试 剂盒，它包括如下试剂：
[0006] (1)洗脱液：
[0007] 洗脱液A: 0.1 % v/v甲酸水溶液；
[0008] 洗脱液B:乙腈；
[0009] (2)标准品溶液:含8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液；
[0010] (3)内标物工作液:含[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷的甲醇溶液；
[0011] (4)稀释液：
[0012] 稀释液1:空白人工尿液基质；
[0013] 稀释液2:甲醇；
[0014] (5)有机溶剂：甲醇；
[0015] (6)质控品：含有8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液，分高中 低三个浓度，分别为QC(H)、QC(M)、QC(L);
[0016] 其中，QC(H)、QC(M)、QC(L)中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷质控品对应浓度见表 1;
[0017]表1 8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷质控品对应浓度(单位ng/mL)
[0018]
[0019] 其中，所述的标准品溶液包括混合标准液C2和混合标准液C3;其中，所述的混合标 准液C2为含浓度为96ng/mL的8-羟基脱氧鸟苷和浓度为97ng/mL的8-羟基鸟苷的空白人工 尿液基质溶液，所述的混合标准液C3为含浓度为9.6ng/mL的8-羟基脱氧鸟苷和浓度为 9.7ng/mL的8-羟基鸟苷的空白人工尿液基质溶液。
[0020] 其中，所述的内标物工作液为含浓度为0.991yg/mL的[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷 的甲醇溶液。
[0021] 其中，所述的空白人工尿液基质为含0.5586g//L二水合氯化钙、0.6099g/L六水合 氯化镁、4.2077g/L氯化钠、2.0596g/L硫酸钠、0.6470g/L柠檬酸钠二水合物、0.0201g/L草 酸钠、2 · 5449g/L磷酸二氢钾、1 · 4388g/L氯化钾、0· 9200g/L氯化铵、2 · 4985g/L尿素和 1.0520g/L肌酐的水溶液。
[0022] 其中，所述的尿液为人或动物的尿液。
[0023] 上述高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷 的试剂盒的制备方法，
[0024] (1)洗脱液：
[0025] 洗脱液A:配制0.1 % v/v甲酸水溶液；
[0026] 洗脱液B:乙腈；
[0027] (2)标准品溶液：
[0028] 分别准确称量5mg的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，于甲醇中溶解定容至10mL，配 制成浓度分别为〇. 48mg/mL和0.485mg/mL的储备液A和B，-20°C保存;取储备液A和B各100yL 混合后用甲醇稀释后定容至10mL，配制成8-羟基脱氧鸟苷浓度为4.8yg/mL，8-羟基鸟苷浓 度为4.85yg/mL的混合标准液Cl，-20°C保存;取100yL混合标准液C1用空白人工尿液基质稀 释后定容至5mL，配制得到8-羟基脱氧鸟苷浓度为96ng/mL，8-羟基鸟苷浓度为97ng/mL的混 合标准液C2;取500yL混合标准液C2用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-羟 基脱氧鸟苷浓度为9.6ng/mL，8-羟基鸟苷浓度为9.7ng/mL的混合标准液C3;
[0029] (3)内标物工作液：
[0030] 准确称量5mg的[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷，用甲醇溶解定容至10mL后得到浓度为 49.55yg/mL的内标物储备液，内标物储备液经甲醇稀释至0.99 lyg/mL得到内标物工作液D; 内标物储备液和内标物工作液D均于_20°C下保存；
[0031] (4)稀释液：
[0032] 稀释液1:分别取0.5586g二水合氯化钙、0.6099g六水合氯化镁、4.2077g氯化钠、 2 · 0596g硫酸钠、0 · 6470g柠檬酸钠二水合物、0 · 020 lg草酸钠、2 · 5449g磷酸二氢钾、1 · 4388g 氯化钾、0.9200g氯化铵、2.4985g尿素和1.0520g肌酐用水溶解并定容至1L;
[0033] 稀释液2:甲醇；
[0034] (5)有机溶剂：甲醇；
[0035] (6)质控品：分别取1 OyL、60yL、120yL步骤(2)中得到的混合标准品C1用空白人工 尿液基质定容至10mL得到。
[0036] 上述试剂盒在利用高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷 和8-羟基鸟苷中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0037]具体检测方法如下：
[0038]采用高效液相色谱串联二级质谱技术分别检测标准品溶液和经过预处理的尿液 样品中的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，先利用高效液相色谱技术将8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷分离，再利用二级质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标 准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的含 量，具体色谱条件为：
[0039] (1)高效液相色谱条件：
[0040] 流动相A: 0.1 % v/v的甲酸水溶液；
[0041 ]流动相B:乙腈；
[0042] 色谱柱为Ultimate Polar_RP，2· 1 X 100mm，3μηι;
[0043] 流速为 0.4mL/min;
[0044] 柱温为 30°C;
[0045] 进样量为10yL;
[0046] 采用梯度洗脱方式，见表1;
[0047]表1液相梯度洗脱参数
[0048]
[0049] (2)质谱条件：
[0050]在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式;喷雾针电压 为5500V;碰撞气为5psi;气帘气为50psi;离子源雾化气和加热辅助气均为65psi;脱溶剂气 温度为550°C。
[0051 ]其中，所述的标准品溶液按照如下方法制备得到：
[0052] 分别准确称量5mg的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，于甲醇中溶解定容至10mL，配 制成浓度分别为〇. 48mg/mL和0.485mg/mL的储备液A和B，-20°C保存;取储备液A和B各100yL 混合后用甲醇稀释后定容至10mL，配制成8-羟基脱氧鸟苷浓度为4.8yg/mL，8-羟基鸟苷浓 度为4.85yg/mL的混合标准液Cl，-20°C保存;取100yL混合标准液C1用空白人工尿液基质稀 释后定容至5mL，配制得到8-羟基脱氧鸟苷浓度为96ng/mL，8-羟基鸟苷浓度为97ng/mL的混 合标准液C2;取500yL混合标准液C2用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-羟 基脱氧鸟苷浓度为9.6ng/mL，8-羟基鸟苷浓度为9.7ng/mL的混合标准液C3;
[0053] 准确称量5mg的[13C，15N2]-8-羟基脱氧鸟苷，用甲醇溶解定容至10mL后得到浓度为 49.55yg/mL的内标物储备液，内标物储备液经甲醇稀释至0.99 lyg/mL得到内标物工作液D; 内标物储备液和内标物工作液D均于_20°C下保存；
[0054] 分别取25μ1、50μL和100yL混合标准液C2用空白人工尿液基质稀释并定容至100yL 作为标准校准点S5、S6和S7;分别取5yL、10yL、50yL和100yL混合标准液C3用空白人工尿液 基质稀释并定容至100μL，得到标准校准点S1、S2、S3和S4;这7个浓度点体积均为100yL;然 后向各组标准校准点中加入15yL 0.99lyg/mL内标物工作液D，混合均匀后用甲醇定容至 〇.5mL，然后涡旋20秒后振荡lOmin，于4°C下12000g离心5min后取10yL上清液，即得标准品 溶液；
[0055] 其中，
[0056] SI、S2、S3、S4、S5、S6和S7作为8-羟基脱氧鸟苷的校准点，S2、S3、S4、S5、S6和S7作 为8-羟基鸟苷的校准点。
[0057]其中，所述的空白人工尿液基质为实验室人工配置的模拟尿液;其中，所述的空白 人工尿液基质由如下方法制备得到：
[0058] 分别取0.5586g二水合氯化钙、0.6099g六水合氯化镁、4.2077g氯化钠、2.0596g硫 酸钠、0 · 6470g柠檬酸钠二水合物、0 · 0201g草酸钠、2 · 5449g磷酸二氢钾、1 · 4388g氯化钾、 0.9200g氯化铵、2.4985g尿素和1.0520g肌酐用去离子水溶解并定容至1L。
[0059] 其中，尿液样品的预处理方法为:取100yL尿液至1.5mL离心管中，加入15yL内标物 工作液D后混勾，再用甲醇定容至0.5mL，漩祸振荡lmin，于4°C下12000g离心5min，取10yL上 清